1.1雨生红球藻的培养地点

雨生红球藻的培养地点位于海南省三亚市吉阳镇南繁大棚内。

1.2雨生红球藻的培育方法

雨生红球藻适宜生长的温度为25-28℃,光照强度为2778-5556 lx。雨生红球藻通常在相对湿度60%~ 80%的环境中生长较好，在此范围内,藻类能够有效地进行光合作用和营养吸收。另外,藻类对于光照的需求存在一个最佳区间,它介于补偿光照强度与饱和光照强度之间。在此光照区间内,随着光照强度的提升,光合作佣会加速进行 ,从而促进藻群生物量的增长。然而,一旦光照强度达到饱和点之后,光合作用的速度将会减缓,甚至可能受到抑制。因此,为了精确控制光照强度,我们在大棚的顶部安装了可调节的遮光网。在阴天时打开遮光网,以增加光照;晴天时则适当关闭遮光网,确保雨生红球藻处于最佳生长状态。在整个培养过程中,我们定期打开大棚四周的塑料薄膜以促进空e气流通,防止气温的急剧升高,确保维持在20~28℃的范围内。

1.3培育雨生红球藻的气候条件

培养雨生红球藻的气候数据,包括气温、降水量、风速、湿度和雷暴等,均来源于中国科学院生态系统研究网络三亚气象站的公开资料,以及2005-2019年间中国气象局公布的气象统计资料。此外,还参考了《2010-2018年海南省海洋环境状况公报》和中国气象局热带气旋资料中心提供的自然灾害统计数据。雨生红球藻培育的气候条件:平均气温为26.2℃，雨生红球藻培养期内(11月至次年4月)的平均气温低于26.9℃，月平均湿度为75%。

1.4雨生红球藻中蛋白质与氨基酸含量的测定

依据GB5009.5-2016《食品安全国家标准食品中蛋白质的测定》中的凯氏定氮法测定蛋白质成分。雨生红球藻细胞壁较厚, 实验前需用高压匀浆法进行细胞壁破碎,通过氮含量剩以蛋白质转换系数(通常为6.25 )得到蛋白质总含量。氨基酸含量分析采用高效液相色谱法测定,将样品用盐酸进行水解,衍生化试剂可以用OPA (邻苯二甲醛 )和FMOC-CI(9-氟烷基甲氧基羰酰氯)。

2.1三亚气候条件分析

三亚地处低纬度地区,受副热带海洋性季风气候控制15。尽管日照充足，日间气温较高,但得益于海洋的调节作用,年温差较小，四季变化不明显。冬季主要受东北风影响,而夏季则以西南风为主。由于海洋的调节,三亚的空气钟水气含量较高,气湿润。

2.1.1气温

三亚市在1996至2019年间的年平均气温为26.2℃ ,平均极端高温为34.9℃,平均极端低温为13.3℃。三亚市全年各月的平均气.温均保持在21℃以上,其中5月至8月为高温期,平均气温超过28℃ ; 11月至翌年3月的气温相对凉爽,平均气温低于24.6℃。三亚市2023年具体的月平均气温数据详见表1 , 1996年至2019年全市的平均气温及气温极值情况详见表2。

表1 2023年亚全市各月平均气温

表2  1996- 2019年三亚全市平均气温及气温极值

2.1.2降水特征

三亚市区的降水量全年充沛 ,各月均有降水记录。年平均降水量达到1 392 mm ,年均降水日数为113d ,具体统计数据详见表3。三亚的气候可以明显区分为早季和雨季,雨季为5月至10月,期间的降水量占全年的85%以上,降水日数也占到了75%以上; 11月至次年4月为旱季,该时期的降水量相对较少。

历史降水数据表明, 1990年的降水量最高,为1 987.7 mm; 1977年的降水量最低,仅有673.7 mm。1986年5月 20日的单日降水量最大,高达327.5 mm。三亚市连续降水日数最长达到18 d ,为1967年9月13日至30日,累计降水量为245.8 mm。

表3 三亚市各月降水量、降水日数、平均大雨和暴雨日数分布

2.1.3风况和湿度

三亚的大风天气主要由冷空气和热带气旋引发。热带气旋带来的强风通常在6月至10月期间出现,瞬时最大风速可达30 m.s^-1(NW)。三亚全年平均风速为2.5 m.s^-1。 在风向方面,东风(E)、东北风( NE )和东北东风(ENE)最为常见,几乎占据了全年的8个月时间。而在5月至8月的雨季,风向变化较大,以西风(W)和西南西风(WSW)为注。此外,该地区年平均相对湿度为78% ,全年各月相对湿度变化较小。8月份湿度最高,可达84% ,而12月则相对较干燥,湿度降至70%的年度最低点。各风向的平均风速、最大风速及其出现的频率详见表4；各月平均风速和湿度数据则详见表5。

表4三亚市各方向风的平均风速、最大风速及频率

表5三亚市各月平均风速和相对湿度 

2.1.4灾害气象

三亚地区年平均雷暴日数为63 d ,占全年天数的17.26%。雷暴天数最多的年份可达100d ,占全年天数的27.4% ;最少的年份也有51 d,占全年天数的13.97%。8月和9月是雷暴最频繁的月份,每月平均有13 d出现雷暴。相比之下, 11月至次年2月期间基本没有雷暴。各月平均雷暴日数见表6。2010至2018年间 ,有223个热带气旋在西北太平洋和南海生成,平均每年生成27.9个。有69个热带 气旋进入南海或在南海生成,有13个登陆海南岛。按月份统计,登陆次数最多的月份为7月, 6月和8月为其次, 1月至4月和12月没有热带气旋登陆三亚,登陆三亚的热带气旋按月统计频数见表6。

表6  三亚市各月平均灾害气象日数

综上所述,热带地区在夏季和秋季降水量较大，热带气旋活动频繁,气温较高。然而,雨生红球藻的最佳培育条件是无雨环境并且温度在28℃以下。基于上述条件,我们确定了三亚地区雨生红球藻的最佳培育时间为冬春季节, 即每年的11月中旬至次年的4月初,此时三亚地区的气温较低、降水较少。

2.2培育雨生红球藻的环境条件优化策略

针对三亚地区季节性温度变化的特点,我们为雨生红球藻的培育设计了一套环境调控方案。该方案采用大棚遮荫结合透明塑料袋长型跑道法,以实现对光照和温度的精确控制。具体操作为,在大棚顶部安装可调节的遮阴网,根据天气状况灵活调整光照强度:在阴天时打开遮阴网以增加光照,在晴天时关闭遮阴网以保护藻类免受过强光照的影响。在培养过程中,确保棚内温度控制在20至28温度的的适宜范围内。此外,在日间温度过高时,适时打开大棚四周的塑料薄膜,促进空气流通,防止局部温度过高。

2.3雨生红球藻的培育方法探究

2.3.1培养配方

经过深入研究和反复实验,我们成功研发了一套适合雨生红球藻生长的培养配方 ,该配方的详细组成和剂量见表7。利用该配方经过15 d的培养,藻体细胞密度可达1.5 x 105cellsm.s^-1. 平均生长速度1x 105cellsom.s^-1。 该配方基于对藻类生长营养需求,以及对环境条件的精确控制,为雨生红球藻提供科学配比的营养液和适宜的生长环境。

表7 雨生红球藻的培养配方

2.3.2实验步骤

1)藻种保存与扩繁:在实验室条件下进行藻种的保存与初步扩繁。使用体积为500 mL的三角烧瓶(图2a) , 在经过严格的灭菌处理后,接入藻种。将烧瓶放置于遮阴大棚中,进行约为1周的培养。

2)中间培育:选用大三角瓶、塑料袋或塑料桶作为培养容器,体积范围为5一20L。培养液在灭菌处理后,接入来自前一阶段的藻种，同样进行约1周的培养。

3)大量繁殖:采用塑料袋跑道式培育方法,使用直径20 cm的厚塑料袋,在地面上布置成回形, 形成长18 m、宽60-80 cm的培养跑道(图2b)。

图2  雨生红球澡的藻种培养(a)和塑料跑道培育(b)

2.3.3藻体培育与收获

1)藻细胞密度的增长:在精心培育15 d后,绿色藻体的细胞密度达到1x 105cellso(mLd)-1. 这一阶段标志着培养液中的营养盐已被藻体基本吸收完毕。

2)光照诱导的生理转变:为了促进藻体从游动状态转变为不游动的孢子状态,移除大棚的遮阴网,让藻体接受强光照射。强光照条件触发了藻体颜色的转变,由绿色逐渐变为红色,藻体中虾青素的含量不断增加。

3)收获时机的把握:在接下来的15d内,随着虾青素的不断积累,藻体的颜色更加鲜艳，此时是收获雨生红球藻的最佳时机。

4)藻体的后处理:收获后的雨生红球藻藻体首先经过沉淀和过滤以去除杂质;随后,藻体可以在滤网上自然晒干,形成便于储存和使用的藻片(图3a) ;也可以采用喷雾干燥技术,将藻体转化为易于运输和加工的藻粉(图3b)。

图3 收集的雨生红球澡澡片(a)和藻粉(b)

2.4培育过程中关键控制点的分析

在雨生红球藻的培育过程中,预防纤独、轮虫等原生动物的污染,以及控制细菌的过度繁殖至关重要。因此,对培养液和藻种的严格管理是确保培养成功的关键环节。

本研究采用了塑料跑道培养技术,通过物理隔离有效减少了空气中原生动物的污染。同时实施了严格的灭菌操作,以最大限度地避免生物污染的发生。若培养基的消毒不彻底,随着时间的推移,可能会受到小球藻等绿藻的污染,最终导致整个培养过程的失败。

因此,在雨生红球藻的培育过程中，建立一个封闭式的培养基供应系统,对于减少污染具有重要意义。在塑料跑道技术培育雨生红球藻的过程中, 我们采用了臭氧、精细过滤、紫外和次氯酸钠消毒4种不同的消毒方法(表8)。实验结果表明，结合精细过滤和次氯酸钠消毒法处理培养基的方法在控制污染方面效果最佳,该组合方法成功概率达75%-80% ,对比来看,臭氧消毒法、紫外消毒法则分别只有60%、50%。

表8 塑料跑道培养雨生红球藻的不同消毒方法比较

2.5雨生红球藻中蛋白质和氨基酸的含量

对雨生红球藻的营养成分进行系统的测试与分析,结果表明,雨生红球藻中蛋白质(26.0% -44.0%)和碳水化合物(26.0%- 40.0%)的含量较高,脂肪(12.0%-18.0%)和灰分(2.8%~ 12.8%)的含量相对较低。在雨生红球藻的营养成分中,共发现了15种氨基酸,其中,亮氨酸(4.4%)、酪氨酸(3.9%)和组氨酸(2.4%)的含 量较低,而谷氨酸(13.1%)、氨酸(10.1%)和天冬 氨酸(9.3%)的含量较高(表9)。这为评估其作为营养源提供了重要信息。

表9 雨生红球藻中的氨基酸含量 

2.6雨生红球藻平衡饲料蛋白质的组成

雨生红球藻所含的氨基酸种类较为齐全,通过雨生红球藻产品与含其他蛋白质成分的饲料相结合,可以平衡饲料中的氨基酸组成，提高饲料蛋白质的利用率与饲料的营养价值,从而促进动物的生长和健康。该策略适用于缺乏某些必需氨基酸的饲料蛋白质源，此外,还有助于减少动物对单一蛋白质源的依赖 ,提高饲料的整体质量和可持续性。

3.1微藻光生物反应器技术的多样化

海洋微藻的传统培育方法长期依赖于开放式系统,这些系统虽然易于操作,但受限于生长速度慢、环境污染严重和高污染风险等问题,导致养殖效率和附加值受限。20世纪中叶,科学家开始转向封闭式反应器的探索。Pirt的开创性研究为封闭式光生物反应器技术的发展奠定了基础,这一技术的应用不仅提升了微藻培育的效率,也减少了环境污染,为微藻培育领域带来了革命性的变化。封闭式光生物反应器技术的发展催生了多种设计,以适应不同的培育需求。跑道池技术以其开放式水池设计而闻名,尽管因产量低和过程控制复杂等问题逐渐被淘汰,但它为后续技术的发展提供了宝贵的经验。平板光生物反应器采用透明材料制成的封闭立方体结构,特别适合雨生红球藻的培养,通过灵活调节受光角度,优化光照条件,提高生长效率。柱状光生物反应器以其高径比的圆柱形设计,实现了高效光能利用和均匀光照,适用于大规模培育微藻,具有环保和可持续性特点。管道式光生物反应器通过直管和弯管组成的管道系统,实现培养液的内部循环,适应了多样化的培养需求。

薄膜光生物反应器技术在平板式和柱式光生物反应器技术的基础上发展而来,利用透明薄膜材料,展现出高度的可塑性和多样的设计形态。这种技术通过大面积的光照接触面和竖直空间排列,高效捕捉光能,促进光合作用,适合大规模的微藻培养。尽管半球体式、贴壁培养和暗培养技术等仍在探索阶段 ,未扩泛应用于生产,但管道式光生物反应器因其高效性和灵活性已成为产业主流技术。例如，Maui Tropical Algae Farm (伊岛热带藻类养殖场)和Supreme Biotechnologies (尊生物科技有限公司)采用薄膜式光生物反应器,而Cyanotech (西亚诺泰克)等早期产业化公司则采用跑道池培养,体现了不同技术在产业应用中的多样性和适应性。这些技术的不断发展和优化,为微藻培育产业的未来发展提供了坚实的技术基础和广阔的应用前景。

3.2雨生红球藻的产业化

自21世纪初以来,光生物反应器技术在微藻产业化领域取得了迅猛发展,成为国际研究和商业生产的热点。美国企业如Cyanotech和Aquasearch等,已经成功地将这项技术应用于红藻的商业化生产,而中国也通过近二十年的自主研发和技术引进,雨生红球藻工业化的应用水平显著提升。特别是在云南的企业,利用当地高原气候的优势,广泛应用光反应器技术,推动了虾青素产业的快速发展。全球主要公司在生产雨生红球藻及其虾青素时,普遍采用两步法来有效防止藻类污染,这一方法已成为行业内的首选技术。

在中国,雨生红球藻的生产企业,包括云南雨藻生物科技有限公司和贵州中明生物科技有限公司等,均采用了多样化的培养技术,如跑道池技术、平板式和柱式光生物反应器技术,管道式和薄膜式光生物反应器技术,以及气压技术,以适应不同的生产需求和环境条件。本研究针对海南独特的热带气候特点,创新性地结合了遮阴网调光和跑道式透明薄膜技术,为热带地区红球藻的培育提供了关键技术解决方案,这一-创新不仅提高了培育效率,也增强了产业的适应性和竞争力。本研究所使用的综合培育方案,促进热带地区雨生红球藻养殖产业化的逐步成熟,展现出广阔的市场前景和发展潜力。

3.3热带地区雨生红球藻的关键培育技术

在本研究中,我们借鉴了前人的研究成果,并结合三亚的气候特点,选择了透明塑料袋长型跑道法作为雨生红球藻的培育技术。雨生红球藻的生长与虾青素产出需要适宜的温度,研究发现雨生红球藻最适生长温度为25~28℃。相较于云南与贵州,三亚位于低纬度地区,为热带海洋性季风气候,年平均气温稳定在26.2℃,各月平均气温均在21℃以上。其中,三亚市5至8月的气温较高，平均气温均达到28℃以上,并且此时为雨季。因此,无论是从适宜温度的角度考虑,或是规避洪涝灾害等的角度考虑,雨季并非三亚市雨生红球藻养殖的适宜时期。江红霞使用单因素研究表明,在一定范围内,虾青素含量随温度升高而增加,在25℃时,雨生红球藻的细胞密度和生长速率达到最大值。此外,高桂玲实验发现,低温对虾青素的积累有较大影响,而在高温下这种影响则较小。基于上述研究结果,我们确定了每年的11月中旬至次年的4月初为三亚地区雨生红球藻的适宜培养期。此时的气温相对较低,平均气温低于24.6℃ ,配合塑料大棚的精确温度调控,为雨生红球藻提供了理想的生长环境,确保其始终处于25至28 °C的最佳生长温度区间。此外,选择在旱季进行培育,还有效避免了洪涝等自然灾害的干扰,从而保障了生产的稳定性和可预测性。值得注意的是,高温是热带地区养殖雨生红球藻过程中的-一个障碍,尽管可以通过额外的降温措施应对,但不可避免的带来养殖成本的增加。从成本效益和资源利用的角度出发,企业在选择生产地点时,通常会倾向于选择常年温度适宜的地区进行红球藻的培育。本研究通过在三亚地区采用透明薄膜跑道式培育技术,不仅确保了适宜培养期内雨生红球藻的高速生长和虾青素含量的快速积累,还能够在不增加额外降温成本的前提下,实现了红球藻的高效培育。通过科学的培育策略,我们在三亚实现雨生红球藻商业化养殖的同时,还为热带地区的微藻培育提供了有效的技术示范,展示了在特定气候条件下进行微藻培育的可行性和广阔的经济前景。