随着全球温室气体的过量排放,导致极端气候频发,减少碳排放已经成为全球共识。为此我国提出“双碳” 目标,一方面减少碳的排放,另一方面增加碳的固定。另外由于我国人口众多,粮食资源缺乏,进口依存度高。例如,据国家统计局和中国海关总署统计, 2023年我国主要的蛋白质来源一大豆的83%来自于进口,存在着严重的粮食供给安全问题,因此迫切需要大规模、低成本的非粮技术来弥补蛋白质方面的缺口。

微藻一直被认为可以利用太阳能高光效地生长,微藻每年固定的CO2约占全球净光合产量的40% ,太阳能利用效率可达3%-5% ,但实际上大规模培养的微藻却很少,目前主要工业用藻株包括螺旋藻(Spirulina)、小球藻(Chlorella)、莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardti)等,以及合成生物学技术的平台生物,如集胞藻(Synechocystis)b5。微藻规模培养面临的最大问题是成本太高,影响成本的因素很多,从生产角度看,其实际1%左右的光合生产效率与实验室3%-5%甚至更高的水平差距较大,主要原因是在水生环境下光能和CO2的传递都很受限,局部优化常规工艺的光能和CO2传递强化,通常会带来更高的能耗或者更复杂的设备需求,难以真正用于规模生产。近年来，“液态阳光技术” 快速发展,即以太阳能为驱动,催化CO2和水生成有机物，达到固碳和储能的目的。学者提出,利用甲酸这种太阳燃料为碳传递和能量传递的中间载体,来提高整体的太阳能利用效率。有研究表明,使用2 mmol/L酸处理水稻叶片时,植物获得了最大的抗光抑制能力,推测甲酸可能参与了清除内源性自由基,然而50 mmol/L高浓度甲酸根会抑制光合作用。同样，当甲酸盐作为底物用于莱茵衣藻培养时, 20 mmol/L便会对其生长产生抑制。如图1所示,光系统IL上的色素分子捕获光能,为光合作用的发生提供驱动力,但是甲酸会对光系统的供体侧和受体侧产生抑制,与初级电子受体QA、次级电子受体Qp之间的非血红素铁结合阻断电子传递,同时还抑制质体醌(plastoquinone,PQ)的还原,10- 100μmo/L的甲酸根也会抑制水氧化中心复合物的功能。因此要想实现以甲酸盐作为光合碳能强化载体的目标,一方面要解除高浓度甲酸根对光合作用的抑制,另一方面要提升甲酸的生物转化。对藻种进行大量的自适应进化或者改造,极大限制了甲酸在微藻培养中的应用,目前不具有普适性,且基因改造耗时较长,又不能保证一定起效，因此希望能够找到一种更广谱的方法来实现甲酸作为底物用于微藻培养这一目标。

本研究在前期甲酸利用藻株构建和筛选工作的基础上,从长时间甲酸培养微藻系统中分离到了一株窄食单胞菌,发现该菌株尽管无法在甲酸盐为唯一碳源体系下生长,但是通过藻菌共培养方式,能够显著提升多种微藻对甲酸的耐受及其在甲酸培养基下的光合生长,有望简单有效地解决甲酸抑制光合微藻生长的问题,推进基于太阳燃料的人工生物光合系统,更高效地实现太阳光驱动从CO2到生物质的转化。同时,无论是使用藻菌共培养,还是菌发酵液进行纯藻培养,所获得生物质中蛋白质含量显著提升了约50%。

1.1藻种及培养基

莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardti) P3 ,为之前构建的过表达了叶绿体型磷酸甘油醛脱氢酶的藻株,在磷酸三乙酸酯(tris-acetatephosphate,TAP)培养基中传代培养,另-种培养基为磷酸三 甲酸酯(tris -formate- phosphate,TFP) ,将TAP中的碳源替换为甲酸盐,浓度约为50 mmol/L)，pH值同TAP ,为7.5。蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidesa)来源于中国科学院淡水藻种库,集胞藻(Synechocystis sp.) PCC 6803)来源于天津大学张卫文团队,培养基为BG11,甲酸作为底物时,向其添加甲酸钠至终浓度约为50 mmol/L,pH值同BG-11 ,为7.4。培养基使用前, 121C灭菌20 min。

图1 甲酸在光系统工中的抑制位点示意简图

1.2菌种及培养基

食单胞菌(Stenotrophomonas sp.)分离自C.reinhardtii P3培养过程中。利用16S rDNA鉴定方法, 确定该菌株为窄食单胞菌，培养基为添加甲酸钠至终浓度约为50 mmol/L的L B(Luria- Bertani)[23J,pH值为7.2。培养基使用前, 121C灭菌20 min。

1.3培养体系

培养体系为含100 ml培养基的250 mL锥形瓶。

1.3.1 C.reinhardtii P3和Stenotrophomonas sp.单独培养及共培养

吸取一定量的C.reinhardtii P3种子液, 2 500xg离心5 min ,使用TFP培养基重悬,起始0D750为0.2左右接种(记为C组)。藻菌共培养时, Stenotrophomonas sp.先在含50 mmol/L甲酸盐的L B培养基中培养,起始OD600为0.05左右, 1d后OD600约为3 ,得到足够生物量, 4 500xg离心5 min收集菌体,洗涤3次后转入TFP培养基中培养1 d,1 d后0D600<2 ,培养基中甲酸根浓度为0 ,按照藻OD750为0.2、菌OD600为0.1 (对应OD750为0.08)接种在TFP培养基中共培养(记为CS组)。8 500xg离心15 min收集Stenotrophomonas sp.的TFP发酵液,用0.22μm的膜过滤3次得到滤液,补充甲酸钠至终浓度为50 mmol/L ,之后用于C.reinhardtii P3培养(记为CSV组)。培养过程中调节pH维持在7.5左右。温度为26℃,湿度为30%,24 h光照,转速为80 r/min，光强为50μmol/(m2.s) ,连续培养7d.Stenotrophomonas sp单独培养时,吸取一定量的种子液,起始OD600为0.1 ,接种在TFP培养基中,温度为30℃,转速为150r/min。

1.3.2其他藻单独培养及共培养

共培养菌液的预处理、培养条件与上述一致。 在BG 11培养基中培养的为对照组,在添加甲酸钠的BG-11(记为+ F)以及添加单胞菌和甲酸钠的BG-11中(记为+F+S)培养为实验组。

1.4生长、叶绿素荧光动力学参数以及氨的测定

采用UVNIS分光光度计(ASCO公司)测定C.reinhardtii P3在750 nm处的吸光度0D750 ,测定Stenotrophomonas sp.在600 nm处的吸光度0D600 ,混合培养时测定750 nm处的吸光度。采用叶绿素荧光仪(WALZ公司测定光系统I最大量子产率Fv/Fm和实际量产率Fv /Fm'。 采用纳氏试剂测定培养基中氨的含量。

1.5叶绿素a和叶绿素b总含量的测定

取新鲜藻液1 mL,10 000xg离心2 min收集藻泥,避光加入无水乙醇,萃取2 d以上,使残渣发白,以怃水忆醇为对照,使用多功能微孔板检测仪(TECANg公司)测定665 nm和649 nm处的吸光度11。根据公式(1)得出叶绿素a和叶绿素b的总含量:

1.6甲酸的测定

采用高效液相色谱(Agilent公司)对甲酸进行定性定量。进样量10μL ,流动相为5 mmol/L H2SO4 ,柱温65℃,流速0.6 mL/min,分析时间为30 min ,测定在280 nm处的吸光度。

1.7生物质组成的测定

培养结束后, 2 500xg离心5 min收集藻泥,冷冻干燥1 d得到藻粉,研磨后,取适量的藻粉进行生物质组成的测定。以牛血清白蛋白为标准蛋白溶液,采用考马斯亮蓝G250染色液,测定595 nm处的吸光度,得出蛋白质含量。以葡萄糖为标准溶液,采用蒽酮试剂(30 ml超纯水,87 mL浓硫酸, 0.1g蒽酮, 100℃加热2-3 min溶解)测定621 nm处的吸光度,得到总糖含量。向样品中加入C17:0内标,加入2%硫酸甲醇溶液, 70℃油浴1 h进行转酯化,利用气相色谱仪(Agilent公司进行脂质的定性定分析。

1.8统计与分析

实验设有3个生物学重复。在数据分析中,采用Origin软件,根据生物学重复计算每个数据点的平均值及标准差,并比较数据间的P值。

2.1 Stenotrophomonas sp.的确认

长时间在TFP培养基中传代的C.reinhardtii P3藻液上清呈现浑浊,疑似被细菌污染,考虑到该菌可能具有耐受高浓度甲酸的能力,因此对其进行了分离。通过16S rDNA基因鉴定,使用引物27F (5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG)和1492R (5'-TACCTTGTTACGA CT) ,对PCR产物进行了测序。通过序列比对发现,该菌株属于窄食单胞菌属(Stenotrophomonas) ,与已完成基因组测序的嗜唛芽窄食单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia GYH和Stenotrophomonas maltophilia STEN0024)具有很高的相似性。通过对S.maltophilia基因组进行检索,发现其能够编码内源性甲酸脱氢酶。

2.2 C.reinhardti P3和Stenotrophomonas sp.单独培养

如图2所示,单独培养C.reinhardtii P3时,其呈现出缓慢的生长趋势, 7 d培养过程中, 0D750增加了0.3+0.0 ,消耗氨约1 mmoI/L ;甲酸基本不消耗,维持在50 mmol/L左右。 由于甲酸对电子传递链的抑制, C.reinhardtii P3的Fv/Fm和Fv' /Fm' 在接种1 d后分别下降至0.7和0.5以下,随后缓慢下降。同样,单独对Stenotrophomonas sp.在TFP中进行7 d培养时,发现该菌生物量基本没有变化(图3) ,但能消耗约15 mmol/L的甲酸,说明该菌尽管具有一定的转化甲酸的能力,但难以在甲酸作为唯一碳源、 铵盐为氮源条件下生长,这也与其具有甲酸脱氢酶的推测相吻合。

为了获得足够生物量考察Stenotrophomonas sp.的影响,将Stenotrophomonas sp.使用添加甲酸钠的LB培养基中进行培养，之后离心收获,用TFP清洗后转入TFP进行适应性培养。

2.3 C.reinhardti P3与Stenotrophomonas sp.共培养

将C.reinhardtii P3与Stenotrophomonas sp.在TFP中共同培养7 d ,结果如图4所示, CS组的OD75o增加了2.5+0.1 ,相比C组(0.5+0.1)增加了约4倍。于CS组中OD750包含了Stenotrophomonas sp.的贡献,因此测定叶绿素a和叶绿素b的总含量来表示C.reinhardtii P3生物量的变化。CS组叶绿素a和叶绿素b的总含量增加了(16.3+ 1.4)μg/mL ,相比C组(2.7+0.3)μg/mL增加了约5倍。消耗了约6.4 mmol/L的氨,相比C组(约1.0 mmol/L)增加了约5.4倍。消耗了(38.2+2.0) mmol/L的甲酸,而C组基本无消耗。培养全程, 培养物的Fv/Fm>0.7.Fv' /Fm’ >0.5 ,表明C.reinhardtii P3的光合活性维持在高水平,高浓度甲酸没有如C.reinhardtii P3单独培养那样对其光合作用产生明显的抑制。结果显示,引入Stenotrophomonas sp.大大促进了莱茵衣藻C.reinhardtii P3在TFP中的生长,缓解了甲酸对光合系统电子传递链的抑制,维持了光合活性。

图2Chlamydomonas reinhardiiP3单独培养过程中生物量营养消耗与光合活性的变化

图3 Stenotrophomonas sp.单独培养过程中生物量与甲酸含量的变化

由于在共培养初期,甲酸消耗并不明显,系统仍然保持着较高的甲酸浓度,因此推测此时C.reinhardtii P3高光合活性应该与Stenotrophomonas sp.产生的产物有关,因此,通过滤除菌获得Stenotrophomonas sp.TFP的发酵液,替代菌液进行培养考察,即CSV组实验。

2.4 C.reinhardtii P3在Stenotrophomonas sp.发酵液中培养

在培养初期(前2天) , C.reinhardtii P3光合系统中甲酸产生的抑制得到解除,其生物量、叶绿素含量、铵根的消耗和叶绿素荧光动学参数的变化与共生培养无明显蹉异,最大的不同在于甲酸根并没有明显消耗(图4)。结果示, CSV组培养7 d后OD75o增加了0.8+0.2 ,相比C组(0.5+0.1)增加了约0.6倍。叶绿素a和叶绿素b的总含量增加了(5.2+0.6)μg/mL ,相比C组(2.7 +0.3)μg/mL增加了约0.9倍。消耗了约2.5 mmol/L的氨,相比C组(约1 mmol/L)增加了约1.5倍。基本不消耗甲酸。

进一步分析培养前2天的变化,发现该阶段CSV组叶绿素含量a和b的含量与CS组相当,光合活性甚至略高于CS组(对应的光合活性FV/Fm>0.7,Fv' /Fm' >0.6) ,生长速度较快,铵根的消耗也主要发生在这一阶段。 推测Stenotrophomonas sp.在TFP培养基中释放了某种(或某些)有效成分,可以解除甲酸对光合电子传递的抑制,进而促进生长。而在实验条件下,该物质大约在2 d内耗尽。

图4Chlamydomonas reinhardliiP3.与Stenotrophomonassp.共培养过程中生物量色素营养消耗及光合活性的变化

2.5 C、CS. CSV组微藻生物质成分测定

在培养结束时,分别对C、CS、CSV这3组的生物质组成进行了测定,其中CS组中为藻菌共混生物质的测定结果。如图5所示, CS组与C组蛋白含量具有极显著差异(P <0.01),CS组蛋白含量最高,为52.3% ,相比C组(蛋白含量为33.7%)提高55.2% ,但是作为藻菌共同培养,无法准确判定Stenotrophomonas sp.对蛋白含量的贡献。不过,即便是经过7 d,CSV组与C组蛋白含量仍具有显著差异(P<0.05) ,白含量为49.6% ,相比C组提高了47.2% ,表明Stenotrophomonas sp.释放的有效成分显著促进微藻细胞中蛋白含量提升了约50%。值得注意的是, C.reinahardti在使用TAP进行光合培养或者以Z酸作为碳源进行发酵时,其蛋白含量约占干重的30%。甲酸条件下能够促进蛋白含量的提升, C组的结果与之前其他报道的工作相当10] ,然而引入Stenotrophomonas sp.或其发酵液后,蛋白含量出现了巨大的提升。

如图5所示, 3组的可溶性总糖含量不具有显著差异, C、CS、CSV组的总糖含量分别是17.7%、20.6%、 20.7%。总脂肪酸含量3组之间均具有极显著差异(P <0.01),CSV组含量最高,为8.3% ,其次是C组,为5.7%,CS组最低,为3.6%。CSV组3种主要生物质含量之和占干重78.6%,CS组占76.5%,C组占57.1%。表明Stenotrophomonas sp.或其代谢物结合甲酸能够有效地促进C.reinhardti产生更高品质的生物质。为了证明这一发现的普适性 ,进一步测试了Stenotrophomonas sp.与其他常见微藻在甲酸条件下的共培养。

2.6 其他藻与Stenotrophomonas sp.的共培养

于莱茵衣藻C.reinhardti P3与Stenotrophomonas sp.进行共培养时,没有经过实验室自适应进化以及基因改造,推测该菌普遍能与微藻建立良好的协同作用,所以将Stenotrophomonas sp.与其他常见微藻进行共培养实验。如图6所示,在添加甲酸的情况下,第7天时,小球藻C.pyrenoidesa 0D75o降低约0.6 ,引入Stenotrophomonas sp.共培养后, OD750升高约0.3 ,培养物整体颜色更绿。如图7所示,在添加甲酸的情况下，培养7 d ,集胞藻Synechocystis sp.PCC 6803 OD750没有变化,引入StenotrophomonasFigture 6 Formate as substrate (or not),Stenotrophomonas sp.as the partner (or no) of co-culture experiment of C.pyrenoidesa.(A) The growth curve of C.pyrenoidesa.(B) The consumption of formate when formate as the culture substrate (The picture was taken on the 6th day of culture).sp.共培养后, OD75o升高约0.5 ,同样培养物颜色更深。从图6、图7与图4相接近的变化推测，对于小球藻和集胞藻，当以甲酸作为底物进行微藻培养时,引入Stenotrophomonas sp.同样在一定程度 上能够起到缓解抑制、促进微藻生长的作用,后续将对Stenotrophomonas sp.对其他藻株的影响进行细致的分析。

图5C、CS. CSV的生物质组成

图6 C.pyrenoidesa的甲酸为底物以及Stenotrophomonas sp.共培养对照实验

图7 Synechocystis sp.PCC6803的甲酸为底物以及Stenotrophomonas sp.共培养对照实验

以微藻作为甲酸的生物转化对象,优势在于甲酸中碳为+ 2价,需要额外的还原力到生物质(-1-0价) ,而光合作用恰好可以直接提供符合人们期望的绿色能量。食单胞菌是一种革兰氏阴性菌 ,能够利用复杂碳源包括乙酸等多碳有机酸,并组其碳源的选择性与氮代谢密切相关,然而本研究之前,尽管基因组注释表明其含有甲酸脱氢酶,但是较少人关注到其对甲酸转化的巨大影响。通过C、CS、CSV这3组的对比实验,发现Stenotrophomonas sp.及其发酵液都具有明显缓解甲酸根对C.reinhardtii P3的光合作用活性抑制的作用,这种缓解甲酸抑制的效果可能对于真核和原核光合微藻都有效果。早在20世纪80年代,研究人员就对甲酸对光合作用的抑制和解除进行了探索,认为其抑制作用主要是由于甲酸根化学结构与碳酸氢根相似,因此对部分碳酸氢根结合位点形成了竞争性抑制,而这种抑制可以在-定程度 上通过提升碳酸氢根的浓度加以缓解,但是对于过高的甲酸根浓度,例如25 mmoI/L以_上,缓解作用不明显。然而这些认识无法解释本研究发现的Stenotrophomonas sp.及其发酵液对甲酸根抑制的解除。甲基代谢，尤其是甲酸根的代谢和调控直到近年来才逐渐受到研究人员的关注,然而目前甲酸的整体利用率和利用规模都处于起步阶段。未经甲酸驯化的C.pyrenoidesa (真核生物)、Synechocystis sp.PCC 6803 (原核生物)与Stenotrophomonas sp.的共培养结果表明,在以甲酸为底物时, Stenotrophomonas sp.均能其建立良好的协同关系,推测该活性成分对于微藻普遍具有促生长作用。Stenotrophomonas sp缓解高甲酸条件下对微藻光合活性抑制的机制,可能需要后续开展包括基因组、白、代谢等多个层面的研究才能加以揭示,同时也可以借助质谱等技术鉴定出在其发酵液中影响微藻生理活性的物质。明确该活性成分,有望实现纯藻培养,提高对甲酸抑制光合系统的机制的认识,以及拓展甲酸在微藻培养方面的应用。

基于微藻在不同培养系统的生长变化,推测Stenotrophomonas sp.与微藻在高甲酸根条件下可能存在如下互作机制(图8)。Stenotrophomonas sp.能够转化甲酸并释放了某种活性物质,缓解了甲酸对微藻光台系统电子传递链的抑制,使微藻能够顺利进行光合作用,同时, Stenotrophomonas sp.将甲酸转化为CO2 ,强化了微藻的碳供给;而C.reinhardti释放到培养基中的有机物,也为Stenotrophomonas sp.的生长提供了必需的营养,例如氨基酸或蛋白质。

从应用角度,即使不清楚真正的活性物质及其作用机制,仍然可以通过藻菌共生培养,或者以Stenotrophomonas sp.发酵液作为添加剂进行培养。相比而言,直接使用共生培养或其发酵液可能具有其优势,尤其是在开发普适性的微藻光合转化甲酸方面。于大多数微藻缺乏明确的高效的甲酸利用途径,传统的基因工程和定向进化技术在应用过程中存在诸多限制,因此引入藻菌共生培养，更容易将液态阳光技术与微藻规模培养技术相结合。

在天然微生物中，有一类能够利用甲酸脱氢酶将甲酸氧化释放CO2同时获得还原力 ,然后将获得能量用于推动卡尔文本森循环,对释放的部分CO2进行同化,比较典型的代谢就是真氧产碱杆菌(Ralstronia eutropha H16)l29-30]。而通过引入Stenotrophomonassp. ,借助于物种间的协同,能够更加快速地构建一个人工-生物光合成级联体系,加速太阳光能驱动CO2向蛋白质等大宗化学品的高效绿色转化,有望成为真正可以大规模应用的基于太阳燃料的生物质转化过程(图8)。

本研究以微藻高甲酸根驯化过程中鉴定到的一株Stenotrophomonas sp.为出发菌株,对该菌株及其发酵液对微藻高甲酸根条件下光合培养的影响进行了探索,发现该菌株能够有效缓解甲酸根对光合活性的抑制,促进微藻生长,显著提高微藻胞内蛋白质含量水平,并具有在现有真核和原核工业化微藻培养过程中应用的潜力,有望降低微藻高效光合转化甲酸生产蛋白质等大宗生物质的开发瓶颈，同时也为认识光合作用调控以及甲基代谢提供了新的方向。

图8  基于藻菌共培养方式生产蛋白质的固碳策略