1.1微藻培养

本实验选取的藻种分别为大洋桥石藻(分离自中国东海,由厦门大学近海海洋环境科学国家重点实验室高坤山教授团队提供)和球等鞭金藻(由中国海洋大学海洋生命学院唐学玺教授团队提供)。采用单培养方式对微藻进行批培养,培养瓶置于12、18和24℃的恒温培养箱中,光照强度为100 umol-m2-s^-1，光暗比为12 h :12 h。本研究设置12-24℃的温度区间,因为该温度范围涵盖了两种微藻的最适生长温度。另外,根据IPCC SRES A1F1情景下运行的海洋环流模型,设置6℃的温度变化梯度。该温度设置已被用于探究温度变化对微藻生长、生化组成的影响18,23-24,因此也可用于研究不同温度条件下定鞭藻POC、PON、POP含量与比值的变化。微藻培养瓶每天早晚定时各摇动一次,以防止藻种贴壁生长。用自然海水(取自青岛沙子口沿岸)配制微藻培养液,盐度为30。自然海水依次经脱脂棉和0.2 μm醋酸纤维滤膜过滤后,在121℃条件下灭菌20 min。参考Provasoli's enriched seawater改良配方添加营养盐,即在自然海水中添加硝酸钠、磷酸二氢钾以及微量营养盐(必需微量元素和维生素) ,使培养液中的硝酸根浓度为882 μmol:L1、磷酸根的浓度为36 μmol:L1。两种定鞭藻均按照以上实验条件驯化至少17代再开展正式实验。培养实验中,初始接种密度为104cells:mL 1,微藻培养瓶(Corning,美国)的培养体积为225 mL每个实验处理设置3个平行。

1.2样品测定

自接种日起,天定时取1 mL藻液用Lugol试剂固定后使用生物显微镜(OLYMPUS CX41,日本)和血球计数板(Glaswarenfabrik Karl Hecht GmbH,德国)进行细胞计数。接种第6天起, 24℃下的大洋桥石藻细胞密度极低,不再对其进行观察记录。

所有培养条件下的藻细胞生长到达平台期时,使用滤膜(Whatman GF/F, 25 mm)收集微藻样品27-30，用于测定颗粒有机碳(Particulate organic carbon, POC)、颗粒有机氮(Particulate organic nitrogen, PON)、颗粒有机磷(Particulate organic phosphorus, POP)含量。批培养模拟自然条件下定鞭藻水华状态,平台期对应水华期间定鞭藻丰度最高时期31。GF/F滤膜使用前需进行预处理: 550℃灼烧24 h后,在80℃下用5%盐酸浸泡约30 min,之后使用超纯水冲洗滤膜至pH为中性后烘干备用。过滤后滤膜置于-80℃超低温冰箱保存。

POC、PON的测定利用空白样、Acetanilide标准(总有 机碳(Total organic carbon; TOC)=(71.10+0.23)%(w/w),总有机氮(Totalorganic nitrogen; TN)=(10.34+0.09)%(w/W))和低有机碳含量土壤标准(LoworganiccontentsoilstandardOAS,TOC=(1.61 +0.09)%(w/w),TN=(0.133+0.023)%(w/w))进行质量控制, TOC测定的标准偏差为0.02%(n= 6),TN测定的标准偏差为0.007%(n=6)。于POP测定的滤膜也需先冻干,之后在坩埚中进行高温灼烧(550 °C,24 h),把有机磷酸盐转化为可溶性正磷酸盐。样品冷却至室温后转移至带盖试管中,加5 mL稀硫酸混合后沙浴1 h(96 °C)。等样品再次冷却至室温后, 采用磷钼蓝法显色并用分光光度计(HITACHI U-2910，日本)测量吸光度(光源波长为880 nm),利用L ambert- Beer law计算得到样品中POP含量。

2.1种群生长

球等鞭金藻μmx对温度变化有显著响应(ANOVA,p=0.034;见表1)。随着温度升高,球等鞭金藻μmax呈先下降后上升的趋势: 24℃时μmax(平均值:tSD)达最大值(1.26+0.38) d-1,18℃时达最小值(0.38+0.02) d 1(见图1,表2)。大洋桥石藻umax对温度变化均无显著响应(ANOVA,p>0.05;见表1)。12℃时大洋桥石藻μmax最大(0.63+0.06) d 1,18 °C时最小(0.55+0.03) d-1(见图1,表2)。

表1 温度变化对大洋桥石藻和球等鞭金藻的umax、平台期细胞密度和POC、PON、 POP含量 与比值影响的单因素方差分析(ANOVA)结果

图1 温度变化对大洋桥石澡和球等鞭金藻最大比生长速率u_max(d^-1,平均值:SD)的影响

2.2 POC. PON. POP含量

大洋桥石藻胞内POC、PON、POP含量对温度变化均无显著响应(ANOVA,p> 0.05;见表1),且呈现相同的变化趋势,即随着温度升高而降低(见图3(a)。 其胞内POC、PON、POP含 量的变化范围分别为9.32-19.93 pgcell-1、1.78-3.39 pgcell-1、0.19~0.25 pcell^-1

图2不同温度条件下大洋桥石澡(a)和球等鞭金藻(b)细胞密度(10⁶cellomL^-1,平均值:SD)变化图

球等鞭金藻胞内POC、PON、 POP对温度变化同样无显著响应(ANOVA,p>0.05;见表1)。POC、 POP含量均随温度升高而降低，变化范围分别为4.80- 9.93 pe-cll^-1、0.17 ~0.30 pg-cell¹。球等鞭金藻胞内PON含量(0.71-1.24 pg-cell^-1)则随温度升高呈现先增加后降低的趋势(见图3(b))。对比球等鞭金藻和大洋桥石藻的实验结果可以发现,两种藻的胞内POC、PON含量存在显著差异(p≤0.002;见表3)。大洋桥石藻胞内POC和PON含比球等鞭金藻高至少2.3倍。尽管两种微藻胞内POP含量无明显差异(p=0.091;见表3),但球等鞭金藻胞内POP含量略高于大洋桥石藻(见图3)。

图3温度变化对大洋桥石藻和球等鞭金澡POC、PON、POP哈量(a)- -(c),pgocell- ,平均值tSD)及比值((d)- -(f),mol.mol- ,平均值±SD)的影响

表3不同藻种POC、PON、POP含量的Kruskal-WallisH检验(Kruskal-WallisHTest)结果

3.1温度对种群生长的影响

对于球等鞭金藻,本研究发现其Umax在24℃时比其他温度条件显著增加约59%。尽管升温并没有显著增加其细胞密度,但是极大的促进了球等鞭金藻细胞分裂、繁殖速度,使其更快的达到平台期。以往的研究同样表明,球等鞭金藻更适合在20 ~ 25℃温度之间生长。对比不同温度条件下球等鞭金藻变化,我们发现,球等鞭金藻μmax对温度变化表现出不同适应性:球等鞭金藻可能在相对高的温度下(本研究中24℃)有更强适应性。对于大洋桥石藻,温度变化(12-18℃对Umax和平台期细胞密度几乎无影响，且在24℃条件下培养至第4天起藻细胞密度开始快速下降。研究发现,分离自澳大利亚东海岸的大洋桥石藻最适生长温度为20℃,而分离自南大西洋的大洋桥石藻最适生长温度至少为25℃。微藻分离海域不同,是其最适生长温度不同的原因之一。 本研究中大洋桥石藻分离自中国东海,东海冬、春季海表温度为19.5 ~ 22.0℃大洋桥石藻为该海域优势物种之一,能够在冬季气温较低时快速生长,形成水华。这与本实验中大洋桥石藻能够适应低温,且在24℃条件下无法生长的结果相符。通过对比两种微藻，我们认为相对于大洋桥石藻 ,球等鞭金藻的种群生长对升温有更强的适应力。未来海洋环境中温度持续升高很有可能削弱部分海域大洋桥石藻的竞争优势,进而改变浮游植物群落结构以及海洋生态系统结构与功能。

3.2温度对POC、PON、 POP含量趿比值的影响

微藻胞内POC、PON、POP含 晶差异与细胞体积有关,即,细胞体积越大,胞内POC和PON含量通常越高。本研究中, 球等鞭金藻和大洋桥石藻的细胞体积大小与其胞内POC和PON含量高低(大洋桥石藻>球等鞭金藻)相符。根据佟善英的研究,在20℃氮充足条件下,大洋桥石藻细胞体积约为7-100μm3。球等鞭金藻细胞体积明显小于大洋桥石藻细胞,仅为(24.30土15.43)um。球等鞭金藻更高的胞内POP含量则是需要合成更多磷脂膜以及核糖体以维持较高的Hmax和细胞密度。本研究进-步表明,虽然温度变化能改变微藻胞内POC、PON、POP含量,但并不改变两种微藻间的相对差异。尽管本研究中升温对两种定鞭藻POC、PON、 POP含量与比值均无统计学上的显著影响,但升温确实导致微藻POC、PON、 POP含量和比值发生明显变化(最大变化量为25%)。Sheward通过集成数据同样发现,升温对赫氏艾密里藻POC、PON、 POP含量 与比值影响并不显著,升温使其POC含量降低、POC : POP和PON : POP升高;并且温度与pCO2等环境条件的耦合作用能够明显改变赫氏艾密里藻细胞中有机碳的分配。因此本研究将针对两种定鞭藻POC、PON、 POP含 量与比值在升温条件下的变化趋势进行讨论，该结果将为温度或多种环境因素耦合变化条件下多种定鞭藻POC、PON、 POP含 級比值变化的对比研究提供数据基础。升温使得球等鞭金藻和大洋桥石藻POC : PON总体呈现降低趋势(见图3,表2)。当温度由12℃升高至24 ℃球等鞭金藻POC : PON下降14%。升温(12~ 18℃使得大洋桥石藻POC : PON仅降低1%,但其胞内POC、PON含量分别下降13%、12%。本研究结果显示,相对于PON,POC的下降幅度更大,因此POC更大的下降幅度是导致微藻POC : PON下降的主要原因之一(见图 3(),(b).(d))。Toselan研究表明,较高的温度将增加真核浮游植物对N的需求,加快蛋白质的合成,这与本研究中升温条件下PON下降幅度更小的结果相符。与球等鞭金藻不同的是,大洋桥石藻等颗石藻作为钙化浮游植物的代表性物种,藻细胞能够通过钙化作用产生PIC(颗粒无机碳, Particulate inorganic carbon)。PIC : POC代表颗石藻细胞中碳酸钙与光合作用产生有机碳之比,其比值对认识海洋碳循环具有重要意义。研究表明,不同pCO2条件下,升温会使赫氏艾密里藻POC含量显著降低8%,PIC含量和PIC : POC分别显著升高28%和41%。Gerecht究则发现不同磷浓度培养条件下 ,升温使得颗石藻Coccolithus pelagicus的POC含量无明显变化, PIC含量和PIC : POC均降低40% ~ 60%。由此可见,升温与其他环境耦合变化将改变颗石藻细胞中碳的分配和钙化作用程度。然而，目前温度变化对大洋桥石藻POC和PIC含量变化的影响未见报道1相关数据亟待补充。

升温导致大洋桥石藻和球等鞭金藻PON : POP总体呈现升高趋势,尤其是球等鞭金藻PON : POP随温度升高而升高20%。这主要是由球等鞭金藻POP含量随温度升高而下降( ~ 20%)导致的。全球生态系统模型结果表明,在较高温度下浮游植物产生核糖体的数量将减少、合成蛋白质速率将增加,进而使得PON : POP增加。升温导致大洋桥石藻和球等鞭金藻POC : POP总体几乎无变化。

与大洋桥石藻和球等鞭金藻的结果相反, Bi发现赫氏艾密里藻POC : POP总体随升温呈现下降趋势。这可能与赫氏艾密里藻部分培养条件与本研究中两种微藻不同有关,例如,赫氏艾密里藻为半连续培养,大洋桥石藻和球等鞭金藻为批培养。微藻生长速率、样品收获时间等培养条件能够显著改变微藻POC、PON、POP含量与比值,后续需对相同培养条件下的多种定鞭藻POC、PON、POP含量与比值开展对比研究。

3.3未来海洋升温背景下定鞭藻POC、PON、 POP含 量及比值变化的生态学意义

本研究发现，与大洋桥石藻相比,球等鞭金藻对升温有更强的适应性。这一结果表明,在以定鞭藻为主要浮游植物类群的部分海域,大洋桥石藻可能在未来海洋升温条件下逐渐失去竞争优势。Krumhardt研究表明,随海表温度升高,最适生长温度较低的颗石藻可能会向北迁移或者被暖水种取代。随着海表温度持续升高，当温度 高于微藻最适生长温度后,部分浮游植物生长速率急剧下降,这将导致其所在海域生物多样性和初级生产力下降,进而影响海洋生态系统结构与功能以及物质循环过程。

升温导致两种定鞭藻胞內POC、PON、 POP含 量总体呈下降趋势,尤其是微藻胞内POC含量下降高达25%。Barton对18种海洋微藻光合作用和呼吸作用的研究发现,呼吸作用对温度变化更敏感，导致微藻固碳速率随温 度的升高而下降,这与本研究中POC含量随温度升高而下降的趋势一致。 相反, Zhang通过室外培养实验发现,在低营养盐浓度条件下,升温能促进微藻的光合固碳作用并使得POC浓度增加。可观,微藻固碳能力受温度、营养盐浓度等多因素耦合影响。另一方面,颗石藻的钙化作用在海洋固碳过程中同样发挥重要作用。未来海洋环境中升温、pCO2升等多种条件耦合变化,以往的生物模型和海洋酸化培养实验表明,升温能补偿部分海洋酸化导致的PIC : POC下降。同样发现,升温和pCO2升高耦合变化条件下赫氏艾密里藻PIC : POC总体降低,这表明赫氏艾密里藻钙化作用被削弱,将固定更多的碳并成为碳汇。本研究中POC的降低表明升温会削弱微藻的固碳能力。但上述以往的研究发现,升温与低营养盐浓度、pCO2升高等环境条件的耦合作用反而促进了碳的固定。目前温度变化对定鞭藻光合固碳能力和钙化作用的研究大多集中于赫氏艾密里藻,温度变化以及多种环境条件耦合作用对多种定鞭藻光合固碳能力和钙化作用影响的同步对比研究亟待开展。

本研究定量评估并对比了温度变化对两种定鞭藻(大洋桥石藻和球等鞭金藻)POC、PON、 POP含 量与比值的影响。

(1)球等鞭金藻在种群生长方面对温度变化具有较强适应力,而大洋桥石藻因分离自温度较低海域使其在24℃无法正常生长。

(2)升温使两种定鞭藻的胞内POC、PON、 POP含 量总体呈现下降趋势,但两者因细胞体积不同导致的元素胞内含量种间差异明显。胞内POC和PON含量的排序为:大洋桥石藻>球等鞭金藻,胞内POP含量的排序为:球等鞭金藻>大洋桥石藻。

(3)升温使两种定鞭藻POC : PON总体呈现降低趋势, PON : POP总体上呈现升高趋势。POC的大幅下降导致POC : PON降低,而POP的大幅下降导致PON : POP升高。

总之,本研究发现升温对大洋桥石藻和球等鞭金藻POC、PON、POP含量与比值的影响具有一定的规律 :随着温度升高两种定鞭藻胞内POC、PON、POP总体上呈现含量降低、POC : PON比值降低、PON : POP比值升高的变化趋势。目前已有研究结果表明,尽管升温并非对所有定鞭藻POC、PON、POP含量及比值有显著影响,但将通过改变海洋浮游植物的群落结构、钙化作用以及POC、 PON、POP含量 与比值,进而影响海洋碳循环以及生态系统结构与功能。本研究结果为进一步探究未来海洋环境变化条件下定鞭藻的生理生态学意义奠定基础。浮游植物POC、PON、POP含量与比值受多种生物以及环境因素的影响，未来研究可考虑在多重环境因素变化条件下系统厘清定鞭藻POC、PON、POP含量比值以及PIC含量的变化规律。