压力性损伤旧称“压疮”"褥疮" ，是指压力或压力联合剪切力引起的局部皮肤或皮下组织损伤,多见于围术期或术后固定、慢性消耗性疾病和神经系统疾病等患者的骨突部位(如肩胛骨、骶尾骨和跟骨等。此处通常为着力点,且肌肉附着较少,缺乏肌肉与脂肪的保护作用,因此,受压后持续缺血缺氧、代谢障碍,最终变性坏死。压力性损伤愈合困难,治疗周期长,严重影响患者的生活质量。
压力性损伤的核心病理机制是外力施加-解除循环所引起的组织缺血-再灌注(ischemia-reperfusion, I/R)损伤。其导致创面难以愈合的潜在机制包括氧化应激、炎症系统过度激活、线粒体失调、细胞凋亡等，而氧化应激和炎症反应作为其中的关键机制,在组织损伤后发生的过度级联反应中起到重要作用。因此,靶向氧化应激,减轻炎症反应的药物可能成为治疗压力性损伤的理想药物。
虾青素(astaxanthin, AST)是一种从藻类、 酵母或细菌中提取的酮式类胡萝卜素,化学名为3,3'-二羟基-4,4'-二酮基B,β'-胡萝卜素,分子式为C4oH52O4,其化学结构是4个异戊_烯单位以共轭双键相连,两端由2个异戊_烯单位组成的六节环结构问。研究发现其化学结构中的共轭双键能够将自由基转化为更稳定的产物,中断自由基链式反应,从而发挥强抗氧化的作用。此外,特殊的化学结构使其能够跨越细胞膜,同时清除细胞表面和磷脂膜内部的自由基,故其抗氧化活性远远强于其他类胡萝卜素。研究表明,虾青素的抗氧化活性是叶黄素、β-胡萝卜素和花青素的10倍,是维生素E的100倍。此外,虾青素还具有抗炎、抗凋亡等特性,具有保护心肌细胞、神经细胞和感光器细胞等药理作用,故本文推测虾青素可能具有修复压力性损伤创面的潜在应用价值。
为探究虾青素对压力性损伤创面是否具有保护作用,本文通过磁铁循环压迫释放的方式构建小鼠压力性损伤模型,并通过缺氧/复氧(hypoxia/reoxygenation, H/R)诱导成纤维细胞损伤,探究虾青素对压力性损伤创面和H/R损伤成纤维细胞的影响。
利用实验小白鼠设置对照组，模拟压力环境进行对照，从NIH3T3细胞培养、缺氧/复氧损伤细胞模型构建、CCK-8法检测细胞增殖活性、超氧化物阴离子荧光探针检测细胞内活性氧含量、实时荧光定量聚合酶链式反应检测炎症因子水平、压力性损伤模型构建、分组干预、创面愈合情况观察、创面病理形态观察、免疫组化染色、创面组织超氧化物阴离子荧光染色等方面来对照和研究。
体外实验结果
虾青素对NIH3T3细胞增殖活性的影响
细胞经不同浓度的虾青素处理后24 h, 读取在450 nm处的吸光度值。结果显示,当虾青素质量浓度在50 μmol/L以下时,细胞的增殖活性无明显变化(见图1)。后续根据此实验结果,选用质量浓度为50μmo/L的虾青素进行实验。
图1 不同浓度虾青素对细胞增殖活性的影响
注:与对照组相比, nsp>0.05,*P<0.01.
虾青素对H/R损伤细胞内氧化应激的影响
DHE荧光呈红色,反映细胞内ROS水平。H/R模型组细胞内DHE荧光强度明显高于对照组,而虾青素组荧光强度较H/R组显著降低(P<0.05)。该结果提示,虾青素可显著改善成纤维细胞缺氧/复氧损伤后氧化应激(见图2)。
虾青素对H/R损伤细胞内炎症反应的影响
比较实时荧光定量PCR结果发现,与正常对照组相比, H/R模型组细胞内促炎因子(TNF-a、IL-6、IL-1B)mRNA表达水平显著升高,使用虾青素后,促炎因子mRNA水平明显降低。H/R模型组细胞内抗炎因子(TGF-β、IL-10)mRNA表达水平较对照组降低 ,应用虾青素后,抗炎因子水平明显升高(P <0.05)。该结果提示,虾青素可调控成纤维细胞H/R损伤后的炎症反应(见图3)。
图3 各炎症因子mRNA相对表达量
体内实验结果
造模效果评估
本实验所选用的18只小鼠经5次缺血-再灌注循环后,背部皮肤均可见明显的压力性损伤创面,大体观察可见创面凹陷、痂皮形成,创周红肿,提示造模成功。造模过程中未见小鼠死亡[见图4(a)。
创面愈合率
观察各组小鼠创面愈合图像发现,各组小鼠背部创面均随时间缩小。低、高剂量组各时间点的创面愈合率均显著高于模型组,平均创面愈合速度均较模型组更快[见图4(b)]。剂量组创面愈合率最高,治疗后第7天可见创面明显皱缩,痂皮松动,几乎脱落。
创面组织病理学改变
由创面HE、Masson染色结果可见 ,治疗后第7天,模型组创面组织上皮缺损程度最高,皮下组织坏死形成的空泡最为明显;低剂组仍有痂皮附着,但坏死空泡较模型组显著减少;剂量组痂皮几乎脱落,可见明显的上皮和皮肤附属器再生，上皮化程度最高。
此外,低剂量组炎细胞浸润较模型组减少,新生肉芽组织含量均高于模型组。治疗后第7天,模型组和低剂量组创面部位胶原沉积少于高剂量组,胶原纤维排列杂乱;高剂量组的胶原沉积量高于其余两组,且胶原纤维排列更为整齐[见图5(a)]。
图4 虾青素对压力性损伤创面的影响
图5 各组创面组织病理染色图像
注:图5(b)免疫组化图像中棕黄色代表阳性细胞。
(a) HE and Masson stained images (2.5x), (b) Immunohistochemical images (20x)
免疫组化结果表明,各组均可见TNF-a、IL-6、 TGF-B、 IL-10阳性的细胞。高剂量组创面组织内TGF-B、 IL-10阳性细胞含量明显于其余组, TNF-a、IL-6阳性细胞较其余组 显著减少,提示高剂量虾青素可显著提高压力性损伤组织的抗淡能力,改善缺血再灌注后炎症反应[见图5(b)]。
创面组织活性氧含量
DHE染色红色,反映组织内ROS的含量。本文发现,模型组可见明显的红色荧光,低剂量组的荧光强度较模型组有所减低,而剂量组红色荧光几乎不可见。荧光强度定量分析结果表明,低剂量组的平均荧光强度较模型组有所减低,而高剂量组的荧光强度明显弱于期两组(P <0.05),见图6。
图6 虾青素对压力性损伤创面氧化应激的影响
压力性损伤的发病机制涉及到外部生物力学因素和内部病理生理学因素1。生物力学因素主要包括:
①垂值力。局部组织在受压期间缺血缺氧,大氧自由基蓄积,组织内氧化损伤与抗氧化防御失衡。压力解除后,血流重新灌注,过度的氧供引发组织内氧自由基爆发和炎症系统过度激活;
②摩擦力。皮肤与床单或衣物表面摩擦,角质层受损,被汗渍、尿液等体液浸渍后更易形成压疮;
③剪切力。剪切力是两层组织表面发生相对移动时引起的力,可在压力与摩擦力的基础上加速血管闭塞, 进一步引起微循环障碍]。若损伤部位得不到及时有效的干预,极易出现各种并发症,如肿胀、出血、组织溃烂等,严重的情况下可能并发感染,危及患者生命。因此,研究压力性损伤的修复对提高患者的生存质量具有重要意义。
虾青素是一种天然的脂溶性类胡萝卜素,能够有效清除活性氧和氧自由基,具有强抗氧化特性,可能具有促进压力性损伤修复的潜在作用。研究表明,虾青素可通过调控多种分子和通路发挥抗氧化作用,如NF-KB家族、MAPK2、JAK/STAT-3和 PI3K/AKT信号通路等。近年来,多项研究报道了虾青素在创伤性脑损伤、糖尿病肾病、慢性阻塞性肺疾病等疾病模型中通过激活Nrf2信号通路发挥抗氧化作用。另有研究表明,虾青素可通过下调Wnt/B-Catenin信号、激活MEK/ERK信号,从而抑制炎症反应。
自美国食品药品监督管理局(FDA)于1999年批准虾青素用于膳食补充剂以来,国内外生产了多种以虾青素为主要成分或配方成分的膳食营养补充剂,各类产品价格适中,可在临床上或患者日常生活保健中广泛应用,希望成为皮肤损伤、心血管疾病和神经退行性疾病等多种疾病的辅助治疗手段。
虾青素作为一种强抗氧化剂,能够减轻缺血-再灌注后氧化应激,调控过度激活的炎症系统,从而保护缺血-再灌注引起的组织损伤,促进压力性损伤创面修复。
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