虾青素的来源可分为合成虾青素和天然虾青素,目前市场上约90%的商用虾青素是以石油化:工原料通过化学法合成的,但由于在合成过程中原料本身固有的毒性、多余的副产物等因素,导致化学合成的虾青素用途受限。此外,研究表明天然虾青素比合成虾青素具有更优异的生物活性和更突出的生物功能,如其抗氧化活性比合成虾青素高出近90倍。因此,天然虾青素更受到人们的青睐,在市场上具有更高价值和应用前景。

自然界中虾青素主要以游离虾青素单体和虾青素酯两种形式共存,但游离虾青素单体不稳定极易被氧化。此外,由于天然虾青素分子中β-紫罗酮环上的羟基易与脂肪酸发生酯化反应形成虾青素酯,因此天然虾青素中主要以虾青素单酯和双酯的形式混合共存;而化学法合成的虾青素基本是以游离虾青素单体的形式存在。

天然虾青素的主要来源有水生动物、真菌及藻类等。其中水生动物自身是不能合成虾青素的,但通过食物链关系,虾、蟹、鲟动物也累积有虾青素,其中虾青素累积量较多的有南极磷虾、梭子蟹和三文鱼等。然而,此类水生动物都具有较高的食用价值，直接用于提取虾青素是不合理的;故-般对其废料进行虾青素的提取,但其虾青素累积量相对较低,并多以结合态形式存在且杂质较多。真菌中如法夫酵母、胶红酵母也含有虾青素,而法夫酵母的虾青素含量最高,具有培养周期短等优点。但其虾青素累积量在发酵过程中易受多种因素影响。因此,法夫酵母的生长条件仍需进一步改善以提高天然虾青素在市场的可用性。有研究报道雨生红球藻、小球藻、绿球藻等藻类均含有虾青素。由于雨生红球藻在营养生长期阶段能够迅速合成大量虾青素并累积下来,是藻类中提取天然虾青素的最佳来源。而在限制的生长条件下虾青素积累量可达雨生红球藻干重的1% ~ 5%。

目前,针对从生物资源中提取天然虾青素已开发出各种提取方法,如碱提法、油溶法、有机溶剂法、超临界CO2法、酶解法、微波辅助及超声辅助等。其中,碱提法的碱消耗量大,产生大量的废液会对环境造成严重影响，并且在高温强碱条件下,虾青素易被氧化降解成虾红素。油溶法是采用天然植物油浸取得到虾青素，具有易操作、提取率高等优点;但提取过程耗时较长,并且黏度高的植物油不利于分离纯化获得虾青素纯品。有机溶剂提取法具有简单、高效等优点;但有机溶剂的大量使用会造成溶剂浪费和环境污染等问题,且有机溶剂固有的毒性或挥发性可能会对天然虾青素及其后续产品造成潜在的化学污染。

酶解法几乎不会对虾青素的活性产生任何影响,但缺点是酶制剂价格昂贵。超临界CO2提取法是一种绿色高效的提取方法 ,缺点是设备成本较高且操作相对复杂。微波辅助提取法与超声辅助提取法都是在有机溶剂提取法基础上发展而来的新型辅助提取方法,两者均能与其他提取方法联用,但需要额外配套的实验设备。值得注意的是,在提取过程中微波或超声波的使用对虾青素的稳定性是否存在影响,还需对其进行深入研究。

除此之外,近年来离子液体、深共熔溶剂、超分子溶剂等绿色新型溶剂及双水相萃取法、高压脉冲电场法、超高压微射流法等提取方法的出现为天然虾青素的提取提供了新的技术思路。

离子液体( ionic liquids,ILs )是一类由无机阴离子和有机阳离子组成的在室温下呈现液态的盐,具有蒸汽压低不易挥发、溶解性好且可重复利用等特点。由于其独特的理化性质,离子液体被作为有机溶剂高效提取虾青素的良好替代溶剂。离子液体中常见的阴、阳离子类型见图2 ,其中阳离子类型主要有季铵盐、季鳞盐、咪唑盐、吡啶盐及吡咯盐等,而阴离子则有卤素阴离子、CHzC00-、BF4、PF6、(CFySO3)2N、CFzSO3 和CH3SO3中,咪唑阳离子和具有高氢键碱度的阴离子组成的离子液体具有良好的生物质预处理效果。此外,因咪唑基离子液体的亲水性比吡啶基、季鏻盐和季铵盐离子液体更强,在提取天然虾青素方面应用最为广泛。当前离子液体提取天然虾青素技术主要有离子液体作为破壁剂辅助提取技术和离子液体作为溶剂直接提取技术等。所利用的部分离子液体见表1。

图2 常见离子液体的阴、阳离子结构

表1 离子液体提取虾青素的技术

离子液体体系辅助提取虾青素

雨生红球藻是一种单细胞绿藻 ,其由海藻素、甘露聚糖、纤维素及异质多糖构成的刚性三层细胞壁厚度约为1.8 ~ 2.2μm。雨生红球藻细胞壁的抗机械和抗化学作用性能较强,极大地增加了虾青素的提取难度。因此,从雨生红球藻中提取虾青素的关键在于如何有效地溶解破裂其刚性的细胞壁结构。

研究了10种不同阴离子型的1-乙基- 3-甲基咪唑基离子液体破壁剂用于溶解破裂雨生红球藻的细胞壁辅助提取虾青素,发现阴离子为HSO4、CH3SO3 和CF3(SO2)2N~的咪唑基离子液体的破壁效果较好(图3)。在30。C下用6.7%的离子液体水溶液破壁预处理60 min后,以正己烷作为提取剂其虾青素回收率高达99%以上。同时,该研究发现在温和条件下提取的天然虾青素基本不会发生降解,其生物活性仍然得到很好的保持。该方法关于离子液体结构及其性能之间关系的认识对天然虾青素的高效绿色提取有良好的借鉴价值。

报道了不同阳离子类型的离子液体水溶液作为破壁剂,研究发现雨生红球藻经40%1- J基-3-甲基咪唑氯化盐( [BMIM]CI )水溶液预处理后,以甲醇作提取剂时其提取率可达80%以上。在此基础上,他们提出了[BMIM]C对雨生红球藻细胞壁的破壁机理以及虾青素的提取回收示意图(图4)。此外,该研究还发现咪唑基离子液体比吡啶基、铵基 离子液体具有更强的藻类细胞壁破坏力，且咪唑基离子液体的破坏能力随着阳离子烷基链长度的增长而增加。该机理研究对于从雨生红球藻中提取虾青素的技术发展有重要的指导意义。此外, 学者PINKERT研究也有相似的结论,即咪唑阳离子上的长侧链异原子取代基的极性比短侧链异原子取代基更强,进而表现出更强的细胞壁破坏能力。

图3 雨生红球澡的破壁及虾青素提取示意图

图4 [BMIM]CI破壁机理(a)及虾青素提取( b )意图

学者高红研究发现使用离子液体对雨生红球藻进行细胞壁软化处理后协同超高玉微射流法提取其中虾青素,在最佳工艺条件下提取110 s即可获得较高的提取率,相比于传统的超高压微射流法其提取率可提高18.93%。研究还发现含氨基官能团的功能化离子液体提取率最高,其原因在于氨基官能团不仅可以提高虾青素溶解性,还能够防止虾青素在空气中被氧化降解,可促进天然虾青素的提取和利用技术的发展。除了作为藻类生物的细胞破壁剂外，离子液体同样可作为提取助剂应用于虾、蟹废料中的虾青素提取。以1-乙基-3-甲基咪唑溴化盐( [EMIM]Br )离子液体作为提取助剂,在最优条件下从三疣梭子蟹废料中提取虾青素,得到了47.30μg/g的收率。显然,以离子液体为破壁剂,可提高雨生红球藻等生物资源中虾青素的提取率。然而离子液体在上述技术中仅起到辅助作用，且整个提取工艺操作相对繁琐。因此,有研究者开始从事关于离子液体体系直接提取虾青素的研究,以追求操作简单、绿色高效的虾青素提取方法。

离子液体体系直接提取虾青素

除了作为破壁剂,离子液体还可以直接作为溶剂用于虾青素的提取。实验以7种不同阴离子的咪唑基离子液体为提取剂,乙醇为助提取剂,在超声波功率为75 W的条件下从虾废料中获得了92.7μg/g的虾青素收率,接近较相同条件下常规有机溶剂提取虾青素效率的2倍( 46.7ug/g)。该项探索工作表明了离子液体对天然原料中虾青素的提取具有巨大的应用潜力。相比于咪唑基离子液体，质子型离子液体( protic ionic liquids,PILs )可以承载不稳定的质子并形成氢键,且具有制备简单、成本低、高胜物相容性等优点也可用于天然虾青素的提取[53,61]。乙醇己酸铵( ethanolammonium caproate,EAC) 是一种环境友好、高生物相容性的质子型离子液体,在频率为2.45 GHz、功率为350 W的微波辅助下成功从雨生红球藻中提取出虾青素。研究发现, EAC对细胞壁中的甘露聚糖组分具有极高的溶解性,能在50 s内快速有效地溶解细胞壁并提取虾青素,其提取量高达34.4 mg/g。

与传统有机溶剂相比,大多数离子液体的成本相对较高,因此离子液体的高效循环利用是虾青素提取的关键技术之一。基于此, KHOO展示了一种CO2基烷基氨基甲酸酯离子液体渗透雨生红球藻并用于提取虾青素的工艺,其中二甲基氨基甲酸二甲酯铵( dimethylammonium dimethylcarbamate,DIMCARB )对虾青素的提取效果最好,其提取达27.99 mg/g ,其对雨生红球藻的破壁机制如图5所示。此外,通过简单蒸馏提取液回收的离子液体可连续循环三次以上,且每次循环提取的虾青素的抗氧化能力仍得到很好的保持,表明DIMCARB离子液体在天然虾青素提取工艺中具有广阔应用前景。

图5 DIMCARB对雨生红球澡多层细胞壁的渗透作用机制

此外,离子液体从法夫酵母中提取虾青素也具有较好的成本效益和可持续发展潜力。例如, MUSSAG研究了乳酸胆碱( [Ch][Lac] )和丁酸胆碱( [Ch][But] )离子液体水溶液作为二甲基亚砜( dimethyl sulfoxide,DMSO )的潜在替代物提取法夫酵母中虾青素的性能。结果表明,乳酸胆碱和丁酸胆碱两种离子液体水溶液对虾青素的提取率均低于DMSO , 三者对虾青素的提取率分别为12%、15%、 37% ,其原因可能是需要更长的胆碱基阴离子烷基链长度才能实现虾青素的高效提取。随后,又使用更长阴离子烷基链的辛酸胆碱( [Ch][Oct] )离子液体水溶液(离子液体质量浓度为50% )作为提取剂;在料液比为0.2 g/mL和45 °C下从法夫酵母中联提虾青素和β胡萝卜素60 min后,虾青素提取率达45%。上述研究表明 ,以离子液体为提取剂从法夫酵母中提取虾青素具有良好的应用前景,可作为替代传统提取工艺的一种绿色、高效、经济可行的技术平台。

虽然以离子液体作为提取剂从生物资源中提取虾青素取得了较好的研究成果,但多数离子液体提取体系中仍需有机溶剂的参与。此外,离子液体作为提取剂单独使用也会存在黏度大、价格高等缺点,因此,应探索和发展一种更加绿色环保和可持续的离子液体相关体系来提取天然虾青素,使其在食品、化妆品及制药等重要行业具有更广泛的应用。近年来,离子液体微乳液体系因无有机溶剂参与、高生物相容性等优点已被成功应用于虾青素等生物活性组分的提取。学者张莉莉以四丁基三氟乙酸膦( [P444CF3CO )和辛基三丁基溴化瞵( [P4448]Br )为非极性相,水为极性相,卵磷脂和正丁醇为复合表面活性剂构建高生物相容性的离子液体微乳液体系;在室温条件下从南极磷虾壳废料中获得了48.21ug/g的虾青素,其提取率高达97.75% (图6)。研究发现卵磷脂参与构筑的离子液体微乳液体系有助于提高虾青素的溶解性,是取代传统有机溶剂的良好混合溶剂体系,为天然虾青素的绿色提取体系提供了新的思路和参考。

图6  [P4444]CFzCOO/卵磷脂/J醇/水体系提取虾青素的机理

与此同时,为了减少有机溶剂的使用甚至是无有机溶剂参与,构建新型的离子液体-盐液态双相体系也是天然虾青素提取的一种高效、绿色工艺技术。例如有学者考察了不同季铵盐(季膦盐) -磷酸钾( K3PO4 )双水相体系对虾渣中虾青素的提取效果。实验发现,由于[P4448]Br-K3PO4体系与虾青素之间的键合作用最强, 在35℃下虾青素提取率可高达93.08%。同时,张莉莉构建了六种离子液体-盐双水相体系用于在超声辅助下提取雨生红球藻中的虾青素;其中[P4448]Br-K2HPO4/KH2PO4形成双水相的能力及其对虾青素的提取效果均为最强,其提取率高达96.09%。此外,他们还研究了双水相体系相行为和生物分子迁移特性之间的关系。随后,他们又研究了由离子液体和深共晶溶剂( deep eutectic solvents,DESs )组成的新型双水相体系( aqueous biphasic systems,ABSs )选择性提取雨生红球菌中的虾青素(图7)。结果表明,由于存在较强的氢键相互作用、范德华力和空间位阻效应等因素,其中以[P4448]CI和果糖-氯化胆碱( [ChCI[Fru] )为原料制备的ABSs提取性能最佳，其虾青素提取率达81.27%。此外, [P4448]CI-[ChCI][Fru]新型双水相体系在连续3次循环实验后,仍具有良好的萃取性能。同时，与有机溶剂提取法相比,该IL s-DESs双水相体系选择性提取天然虾青素具有更高效、可循环、绿色环保等优点。

图7 [P4448]C和[ChCI][Fru]双水相体系选择性提取虾青素

使用绿色环保、可循环的离子液体体系为从生物资源中提取天然虾青素提供了多种技术优势,如可替代有毒的挥发性有机溶剂、细胞壁破坏能力强、虾青素回收率高及反应条件温和等。然而,要实现离子液体在生物资源提取工艺的实际应用还需对其工艺的工程相关方面进行持续的研究,如降低离子液体制备成本、减少有机溶剂使用甚至是无有机溶剂参与,最大限度地减少天然虾青素及其最终产品中的试剂残留及潜在污染。此外,液态双相体系是一种具 有应用潜力的提取技术,但从生物资源中提取虾青素方面还没有得到充分的利用和探索。从生物资源中提取天然虾青素的离子液体体系还有很大的探索空间,更安全、更绿色环保、更高效的离子液体提取体系应是之后的研究重点之一。