2.1虾青素干预对小鼠体质量、肝脏指数以及肥胖指数的影响

如图1所示，与CON组相比，HFD组的体质高度显著增加(P<0.001)。AX组小鼠体质量与HFD组相比无明显差异。HFD组小鼠肝脏指数相较CON组高度显著增加(P<0 001) ,而AX组与HFD组相比高度显著降低(P<0.001) 。HFD组肥胖指数比CON组高度显著增加(P<0.001) ，添加虾青素干预后，肥胖指数极显著降低(P<0.01)。上述结果表明， 高脂饲喂导致了小鼠肥胖及肝脏肥大，使其脂肪沉积增加，而虾青素干预则可显著改善肝脏指数与肥胖指数。

图1 虾青素对小鼠体质量(A)、肝脏指数(B)与肥胖指数(C)的影响

2.2虾青素干预对小鼠血脂水平及昼夜节律的影响

从图2可以看出，高脂/高胆固醇饲喂12周后，小鼠血清主要血脂水平呈现总体升高趋势(HDL-C浓度下降)，尤其以TC和LDL-C浓度升高显著,而经过虾青素干预后，高脂所致血脂异常得到显著改善。进一步观察血脂的昼夜节律变化情况,结果显示不同血脂指标在ZT0 (早)、ZT12 (晚)间呈现不同的变化规律且差异明显。

图2 小鼠血脂水平及昼夜节律变化

小鼠是夜间活动的动物，与人的昼夜节律相反。本实验中, ZT0是光照开始的时间，对应于小鼠夜间活动结束;ZT12是光照结束的时间，对应于小鼠休息结束的时间。图2显示，各组TG浓度在ZT0时均极显著高于ZT12时(P<0.01, P<0.001)，呈现显著的早晚差异。ZT12时HFD组TG浓度高于CON组，但差异不显著，而AX组TG浓度均显著低于HFD组(P<0.05) 。TC浓度的昼夜节律变化与TG浓度有所不同，各组在ZT0时TC浓度均略低于ZT12时，但无显著性差异。其中HFD组不管在ZT0时还是ZT12时均高度显著高于CON组，而AX组经虾青素干预后TC浓度明显恢复，并在ZT12时显著低于HFD组。LDL-C浓度的变化更为显著，CON组在ZT12时LDL-C浓度显著高于ZT0时(P<0.05) ,表明正常饲养时小鼠LDL-C浓度呈现典型的昼夜节律变化;在高脂饲养条件下，LDL-C浓度大幅升高,早晚间的差异消失,虾青素干预则显著降低了LDL-C浓度,但尚未恢复到正常水平和昼夜节律。HDL-C浓度的变化与LDL-C浓度相反，CON组在ZT0时高于ZT12时，HFD组在ZT0时高度显著降低,且昼夜节律消失,而虾青素干预可大幅提高HDL-C浓度。

总的来说，高脂饲喂导致小鼠肝脏血脂水平升高(HDL-C浓度除外) ,尤其是TC浓度升高明显，而虾青素干预可以有效降低TC和LDL-C浓度,升高HDL-C浓度,改善脂质的代谢。血脂的昼夜节律波动是正常的生理现象,反映了机体昼夜代谢活动的差异，高脂饲养条件下，脂代谢的负荷增加，打破了正常的脂质波动规律,呈现异常的血脂昼夜节律变化。推测虾青素干预能改善脂质代谢，部分恢复血脂水平和正常节律。

2.3虾青素干预对高脂诱导的肝损伤的缓解作用

当肝细胞受到实质性损伤时,胞浆中的ALT与AST会被释放出来，导致其在血清中的活力上升。因此，血清中ALT、AST活力是衡量肝损伤的最佳特征标记。图3结果显示，与CON组相比，HFD组小鼠血清中ALT和AST活力均高度显著升高。AX组ALT、AST活力较HFD组极显著降低,但没有回落到CON组水平。表明HFD组小鼠存在显著的肝受损情况,添加虾青素干预则可显著缓解肝脏的损伤。

图3 小鼠血清AST (A)、ALT (B)湖Fig.3Serum AST (A) and ALT (B) activity in mice

2.4肝脏组织病理学变化分析

图4 小鼠肝脏组织HE染色结果Fig.4HE staining of liver tissue in mice

如图4所示，HFD组小鼠肝叶细胞肿胀,大小不一的脂滴散布于胞质中，细胞核居边，细胞与细胞之间的界限模糊不清，肝窦狭窄,肝小叶内及汇管区有炎性细胞浸润。AX组脂肪变性与炎性浸润程度较HFD组都有相应减轻。

2.5 虾青素对肝脏脂代谢相关基因mRNA表达情况的影响

图5 肝脏脂代谢相关基因mRNA表达情况

如图5所示，FASN是内源性脂肪酸合成的限速酶，在控制脂肪酸合成中具有重要作用。CON组中FASN mRNA的表达存在显著的昼夜节律变化，即ZT0时(反映动物的活动状态)的mRNA表达高度显著高于ZT12时(反映动物的休息状态) (P<0.001) ;而在高脂饲养条件下，FASN mRNA表达的节律变化发生显著改变,在ZT0时mRNA表达量极显著低于CON组(P<0.01),而在ZT12时反而高度显著高于CON组，反映了高脂饲养导致FASNmRNA表达及内源性脂肪酸合成节律的絮乱。经虾青素干预后，FASN mRNA的表达量恢复到正常节律特征(ZT0时高、ZT12时低) ,并均低于CON组的表达水平,表明添加虾青素干预后，FASN mRNA表达及其代表的内源性脂肪酸合成在ZT0和ZT12时同步受到抑制。

CD36是肝细胞.上摄取脂肪酸的受体,其mRNA表达也呈现昼夜节律变化,其在ZT0时的表达量高于ZT12时。而HDF组CD36 mRNA的表达显著上调,早晚间的表达差异缩小。虾青素干预则可同步增加CD36 mRNA在早晚的表达量。

上述结果表明，虾青素对改善高脂条件下内源性脂肪酸的合成和血液中脂肪酸的摄取有显著作用,同时其对高脂所致相关基因表达的节律紊乱有较好的保护作用。

2.6 虾青素干预对肝脏胆固醇代谢相关基因mRNA表达与节律变化的影响

如图6所示，HMGCR是胆固醇合成的关键酶，HMGCR节律表达特征与FASN和CD36完全不同，它主要以ZT12时(小鼠的休息时间)的表达为主。正常小鼠HMGCR m RNA水k平在ZT 12时高度显著高于ZT0时。HFD组HMGCR m RNA早晚的表达都高度显著降低,但以ZT12时为主，此时,胆固醇的合成受到显著抑制,早晚间的波动差距(幅度)减小。AX组有所恢复，但作用并不明显。

图6 肝脏胆固醇代谢相关基因m RNA表达与节律变化

CYP7A1是胆固醇氧化合成胆汁酸的关键酶，其表达的上调可促进肝脏胆固醇从胆汁中排出。CON组在ZT12时的CYP7A1 mRNA表达量极显著低于光照开始(ZT0)时，而HFD组则主要在ZT12时表达量升高,从而表现出与CON组相反的昼夜节律波动, AX组可以纠正这种波动异常,要上调ZT0时的表达，与CON组相似。

2.7 虾青素对肝脏时钟基因mRNA表达量及昼夜节律的影响

生物钟核心转录因子CLOCK/BMAL 1通过结合转录调控元件增强盒(enhancer- box, E-box)调控时钟基因的表达及昼夜节律变化。核心回路中，BMAL1和CLOCK在细胞核内形成异二聚体与PER和CRY基因启动子区的E-box结合,从而激活PER与CRY基因的转录。当PER与CRY在细胞质中的积累达到阈值，PER和CRY蛋白形成二聚体PER/CRY,进入细胞核竞争性抑制CLOCK/BMAL1二聚体与E- box结合从而抑制其转录,通过这种负反馈调节参与生理过程与生物钟的调控。

如图7所示，CON组CLOCK m RNA的表达存在显著的昼夜节律变化, ZT0时高度显著高于ZT12时(P<0.001)。高脂饲养条件下昼夜节律消失,在ZT0时HDF组高度显著低于CON组(P<0.001) ;而在ZT12时HFD组略低于CON组，但无显著性差异。CLOCK/BMAL1 是生物体内相对保守的、以转录翻译为基础的自身转录调节回路。有研究表明，BMAL1基因的绝对表达量低于CLOCK基因,所以BMAL1基因的mRNA表达调控着CLOCK/BMAL1异二聚体含量[ 19]。BMAL 1基因的表达存在着显著的昼夜节律,光照开始时(ZT0)，H F D组极显著低于C 0 N组，经虾青素干预后B M AL 1mRNA表达量得到高度显著恢复(P<0.001) ;在光照结束时(ZT12) BMAL1 mRNA表达量高度显著低于光照开始(ZT0)，且各组间mRNA表达量趋于一致, 且无显著差异。高脂饲养条件下，BMAL1 m RNA表达量昼夜节律振幅降低,虾青素干预能改善高脂所致的节律异常。

图7 生物钟核心转录因子CLOCK (A)、BMAL1 (B) mRNA表达与节律变化

目前关于NAFLD发病机制的研究已取得非常大的进展，“二次打击”(肝脂肪变性所形成的“初次打击及细胞内氧化应激等导致的“二次打击”)学说已被普遍认同。高脂/高胆固醇饮食会引起显著的脂质积累和氧化应激,可能诱发NAFLD等多种慢性代谢疾病。虾青素是天然的抗氧化剂,能改善高脂饮食所致的肝脏氧化应激状态和脂质过氧化[23,241,从而打破高脂小鼠的肝脏氧化应激和末端激酶激活的恶性循环。本研究结果显示，饲喂12周后HFD组小鼠体质量、肝脏指数和肥胖指数均显著增加，虾青素干预能显著抑制高脂/高胆固醇饮食诱导的肝脏指数、肥胖指数的增加。虾青素还能降低小鼠肝脏TC和LDL_C浓度,提高HDL-C浓度,降低ALT、AST活力,从而降低血脂水平，缓解肝脏的损伤。在代谢途径上，检测结果显示虾青素能降低脂肪酸合成限速酶FASN的表达，抑制脂肪酸的合成,此外,虾青素也能降低胆固醇合成关键酶HMGCR在肝脏中的表达，减少内源性胆固醇的合成，同时提高CYP7A1的表达，促进胆固醇氧化生成胆酸,促进胆固醇的分泌与排出。有研究显示，虾青素可诱导肝组织ATP结合盒转运蛋白A1/G1的表达，从而增强了载脂蛋白A-1/HDL介导的肝X受体(liver X receptor, LXR)非依赖性巨噬细胞胆固醇流出1271。这与本实验观察到AX组小鼠HDL-C浓度显著于CON组与HFD组相印证。

哺乳动物的代谢活动具有明显的节律特点，肝脏作为外周时钟系统的主要器官控制组织的代谢节律。核心节律转录因子CLOCK和BMAL 1及其靶基因PER和CRY构成自反馈调节机制, PER和CRY基因表达产物反馈抑制CLOCK-BMAL1复合物,抑制其自身的表达[291。核心回路与代谢相关核受体相连接,通过核受体亚家族1 D组成员1 (nuclear receptor subfamily 1 group D member 1, REV-ERBa)、维甲酸相关孤核受体a (retinoid-related orphan receptora, RORa)及过氧化物酶增殖体激活受体a (peroxisome proliferators-activated receptora, PPARa) 调节代谢。REV-ERBa和RORa既可以反馈调节核心节律分子的表达，也可以影响胰岛素诱导因子2 (insulin-induced gene 2, INSIG2)的表达，促进了固醇调节元件结合蛋白(sterol-regulatory element binding proteins,SREBPs)的激活。SREBPs决定着胆固醇和脂肪酸合成中具有关键功能的酶的节奏表达。有研究显示，SREBP2调控HMGCR的循环转录，胆固醇节奏性的产生可以引起LXR核受体的循环激活，其作为CYP7A1转录的关键激活剂催化胆汁酸合成中的限速步骤,受核因子法尼酯X激活受体/小异二聚体伴侣途径的调控,后者也同时受REV-ERBa的调节。因此,节律循环通过核受体介导调节脂肪酸与胆固醇的合成与代谢,从而改善脂质代谢。本研究中,高脂高胆固醇饲喂导致小鼠脂代谢负荷增加的同时，也破坏了正常的脂质波动规律，虾青素干预能够缓解或修正由高脂导致的生物钟节律相关基因CLOCK和BMAL1以及肝脏早晚脂质和胆固醇代谢相关基因昼夜节律表达的紊乱。文献报道，虾青素是PPARa的激动剂, PPARa可以通过与BMAL 1和REV-ERBa的启动子区域PPAR反应元件结合，调节BMAL1与REV-ERBa的转录,此外, PPARa通过促进INSIG2的表达抑制SREBPs的活化。这与本实验中观察到的HFD组BMAL1 mRNA表达量显著低于CON组,虾青素干预后极显著恢复相似。通过这一证据可以推测， 虾青素对生物钟的调节作用也许与虾青素能增强PPARa的活力有关。

本实验研究了虾青素对NAFLD的干预作用，并观察了虾青素对高脂所致节律紊乱的改善作用。为进一步研究虾青素的营养干预及其节律调节作用提供了依据。

[1]澎湃新闻 《全国爱肝日 脂肪肝不止找胖子 这些人也要注意》

[2] 左正宇,邵洋,刘杨,等.虾青素对肝脂代谢与昼夜节律的调节作用[J].食品科学,2019,40(03):165-172.