1.1原料与试剂

雨生红球藻孢子粉(云南绿A生物工程有限公司);食品级红花籽油(丽江红土地植物油厂);二甲基亚砜为分析纯。

1.2主要仪器与设备

JN-6000低温超高压连续流细胞破碎机,压力:0~207MPa,流量385m L/min(广州聚能生物科技有限公司);Malvern Naro-ZS90粒度分析仪(中山大学药学院)。GBC-916型紫外可见分光光度计(上海精密科学仪器有限公司),显微镜(日本奥林巴斯公司);CF7D2型台式离心机(无锡瑞江分析仪器有限公司);ER-82B型分析天平(日本A&D公司);HHS型电热恒温水浴锅(上海市实验仪器厂)。

1.3试验方法

1.3.1超高压提取

精确称取干燥的雨生红球藻孢子100g，按一定比例加入红花籽油，以385m L/min流量泵入高压容器内，达到一-定压力后在4°C下破壁处理破壁液离心分离得到虾青素提取液及藻渣。

1.3.2虾青素含量测定及计算

(1 )供试品溶液制备精密称取003g样品于离心试管中加5m L二甲基亚砜溶液振摇溶解,置50°C恒温水浴锅中振摇提取10min。再在转速为3500r/min下离心2min,取.上清液移至25m L容量瓶中。再向离心试管中加入5m L二甲基亚砜溶液重复上述操作直到样品变为灰白色时，合并提取液用二甲基亚砜定容至刻度，摇匀取1-10m L容量瓶中，用二甲亚砜定容至刻度,摇匀即得。取供试品溶液于1cm玻璃比色皿中，于492nm波长处测定吸光度,计算即得样品以全反式虾青素计算的总虾青素含量。

(2)结果计算。

式中:X-试样中总虾青 素含量(以全反式虾青素计,%);C--根据测定的吸光度值在标准曲线上查得的样品虾青素浓度(ug/m L);m--样品取样量(g)。

1.3.3虾青素转移率计算

虾青素转移率(%)=提取物中虾青素含量x所得提取物重量藻粉虾青素含量x藻粉重量。

2.1超高压提取工艺参数的确定

2.1.1提取溶剂

虾青素具有脂溶性不溶于水，溶于大多数有机溶剂及植物油，研究分别选择甲醇、乙醇、丙酮、氯仿、石油醚、乙酸乙酯等常用有机溶剂及其配比溶液为提取溶剂进行超高压提取，结果表明考虑到产品中溶剂残留的安全性问题，尽量选呒毒无害溶剂，因此最终选用乙酸乙酯、乙醇混合溶剂作为提取溶剂6。本研究选用食用油做为溶剂作为软胶囊剂型的原料,减少回收溶剂环节既无溶剂残留,又避免了虾青素被氧化的可能，可以降低提取成本，减少环境污染，提高产品品质等优点。

2.1.2液固比

精确称取样品5份各100g，分别加入6、8、10、12、14mL/g红花籽油在200MPa压力下,操作4℃温度下以385mL/min流量进行破壁提取实验研究,计算虾青素转移率。

虾青素转移率随液固比的增加而增加。液固比由6倍量增加到10倍量时虾青素转移率显著增加;当液固比超过10mL/g后转移率无明显增加;液固比为14mL/g和10mL/g时的转移率无显著差别。另外，实验过程中发现液固比低于10mL/g时,由于样品黏度大，易造成单向阀堵塞而且破碎过程时摩擦阻力大,破碎时温度升高。从生产的成本考虑确定液固比为10倍量。

2.1.3提取压力

压力是超高压提取技术的重要技术参数大小对提取物的转移率、溶解平衡速率及红球藻细胞的破壁等都会产生影响。在其他工艺参数都相同的条件下,即操作4℃温度液固比10m L/g,流量385m L/min时，考察提取压力对虾青素转移率的影响。

当压力在100~200MPa范围内时,虾青素转移率随压力升高显著增加，提取压力达到200MPa时,破壁完全,虾青素转移率最高。说明在这一压力下虾青素基本达到破壁及溶解平衡，并且考虑到设备安全及投资的经济性，确定提取压力为200MPa。

2.2追加试验

以上单因素试验所得含油藻渣均为仍含有少量虾青素为了提高雨生红球藻的利用率，使虾青素充分提取出来，对藻渣进行了二次提取提取溶剂为红花籽油，液固比10m L/g. 提取压力200MPa，提取温度4℃，离心分离，分离液用做下一次超高压破壁提取的初液。

结果表明，虾青素的二次转移率达到6%左右藻渣为灰白色，虾青素基本被提完全。综合上述试验结果得出超高压提取雨生红球藻中虾青素的最优工艺条件为:

提取溶剂为红花籽油，提取压力200MPa提取温度4℃提取2次液固比分别为10mL/g。

2.3重现性实验

为了验证优选工艺条件是否稳定可行，做了3组平行试验，虾青素的转移率分别为96.20%、96.56%和97.88%均值为(98. 12+0.26)%重复性很好,因此可以说明所验证的工艺为最优提取工艺。

2.4雨生红球藻细胞高压处理前后的形态

在超高压作用下雨生红球藻细胞在超高压处理后完全破裂，颜色由鲜红色变成了浅灰色或者无色透明，说明雨生红球藻细胞中的虾青素基本被提取完全。

2.5雨生红球藻孢子高压破壁处理前后的粒度分析

雨生红球藻孢子原细胞孢子直径25~30μm(1μm=1000nm),在提取压力200MPa，提取温度4℃提取2次，液固比分别为10m L/g,破壁后的最大粒度为1280nm,最小粒度为255nm,平均粒度为802nm,详情见图1。

图1  雨生红球藻孢子高压破壁处理前后的粒度分析

利用超高压法破壁并提取雨生红球藻中虾青素,具有工艺简单、提取时间短、转移率高等优点，选择食用油作为提取溶剂经济环保低温提取可以避免高温对虾青素的影响。超高压提取只在升压阶段的短暂时间内消耗很少的电能保压和卸压时均不消耗能星设备的损耗和能耗都很小，降低了生产成本。