1.1 细胞活力测定

将IPEC-J2细胞含量调至106个/mL,以每孔100 μL接种于96孔板中,当细胞长至70%时,开始试验。试验分为5组: C、Z、ZA1、ZA2和ZA3组 ,每组有4孔重复。C组和Z组使用普通培养液, ZA1、ZA2和ZA3组分别使用含虾青素5、10和20 μmol/L的培养液，置于细胞培养箱中培养12h后,向Z、ZA1、ZA2和ZA3组加入ZEN使其浓度为25 μg/mL，继续培养24h后,根据之前学者研究实验方法,利用CCK8试剂盒在450 nm波长测定每孔的吸光度(OD)值测定细胞活力:细胞活力=(OD检测-OD白)/(OD阴性对照-OD空白)X 100%。

1.2 LDH活性测定

试验分组及处理同1.2.1。细胞培养结束后,收集上清液,利用试剂盒测定LDH活性;计算公式为: LDH活性(U/L)=(OD检测-OD对照)(OD标准OD空白)x200。

1.3 抗氧化指标水平的测定

将细胞含量调至10个/mL,以每孔2000 μL 接种于6孔板中, 当细胞长至70%时,开始试验。试验分组及处理同1 .2.1。细胞培养结束后,收集细胞,利用试剂盒测定细胞中每毫克蛋白GSH-Px、SOD、T-AOC和MDA的水平。

1.4 细胞因子水平的测定

试验分组及处理同1.2。细胞培养结束后,收集上清液,利用试剂盒测定IL-4、IL-1、IL-6和 TNF-α水平。

1.5 内质网应激相关基因mRNA表达水平的测定

细胞分组及处理同1.2.1 ,细胞培养结束后,常规提取总RNA并逆转录合成cDNA;然后荧光定量PCR仪检测虾青素对ZEN诱导的IPECJ2细胞甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)、激活转录因子6(ATF6)、C/EBP同源蛋白(CHOP)、 B淋巴细胞瘤2(Bcl-2)、B淋巴细胞瘤-XL(Bcl-XL)和BcI-2关联X蛋白(BAX)基因mRNA表达水平，通过2:00Ct法计算各基因的相对表达量。引物信息见表1。PCR反应程序如下: 95℃预变性5 min；95 ℃变性20s, 56℃退火25s, 72℃延伸15s,共40个循环。

表1 引物信息

1.6 数据处理

采用单因素方差分析对试验数据进行统计分析,如方差分析存在差异显著性再采用多重比较(L SD法)对各组间差异进行分析;结果以“平均数t标准差’表示。以P<0.05为差异显著,以P<0.01为差异极显著。

2.1虾青素对ZEN诱导的IPEC-J2细胞生长和细胞活力的影响

结果见图1和图2A,Z组IPEC-J2细胞活力显著低于C组(P<001),ZA1、ZA2和ZA3组细胞活力显著高于Z组(P<0.01),ZA2和ZA3组细胞活力显著高于ZA1组(P<0.01或P<0.05)。

2.2虾青素对ZEN诱导的IPEC-J2细胞LDH活性的影响

结果见图2B,组IPEC-J2细胞LDH活性显著高于C组(P<0.01),ZA1组、ZA2组和ZA3组IPEC-J2细胞LDH活性 显著低于Z组(P<0.01),ZA2组和ZA3组IPEC-J2细胞LDH活性与ZA1组相比无显著差异(P>0.05)。

2.3虾青素对ZEN诱导的IPEC- J2细胞抗氧化水平的影响

结果见图3A和3B,Z组细胞SOD、GSH-Px和T-AOC水平 极显著低于C组(P<0.01),ZA1、ZA2和ZA3组 显著高于Z组(P<0.05);Z组细胞MDAz平极显著高于C组(P<0.01),ZA1、ZA2和ZA3组显著低于Z组(P<0.05)。

图1 虾青素对ZEN诱导的IPEC-J2细胞生长的影响(100*)

图2 虾青素对ZEN诱导的IPEC-J2细胞活力( A )和LDH活性( B )的影响

图3 虾青素对ZEN诱导的IPEC-J2细胞抗氧化酶水平的影响

2.4虾青素对ZEN诱导的IPEC-J2细胞细胞因子水平的影响

结果见图4,Z组细胞IL-1、IL-6和 TNF-a水平极显著高于C组(P<0.01),ZA1、ZA2和ZA3组极 显著低于Z组(P<0.01);Z组细胞IL _4水平极显著低于C组(P<0.01),ZA1、ZA2和ZA3组极显著高于Z组(P<0.01)。

2.5虾青素对ZEN诱导的IPEC-J2细胞内质网应激通路相关基因mRNA表达的影响

结果见图5, Z组细胞ATF6、CHOP、BAX基因mRNA表达水平和BAX/BcI-2比值均极显著高于C组(P<0.01),ZA1、ZA2和ZA3组极显著低于Z组(P<0.01),ZA2组显著低于ZA1组(P<005),ZA3组细胞ATF6和BAX基因mRNA表达水平和BAX/BcI-2比值也显著低于ZA1组(P<005)。

Z组IPEC-J2细胞Bcl-2和BcI-XL基因mRNA表达水平极显著低于C组(P<0.01),ZA1、ZA2和ZA3组显著高于Z组(P<0.05),ZA2组细胞Bcl-XL基因mRNA表达水平显著高于ZA1组(P<0 05),ZA3组细胞Bcl- 2和Bcl-XL基因mRNA表达水平也显著高于ZA1组(P<0.01)。

图4 虾青素对ZEN诱导的IPEC-J2细胞IL-1、IL-4、 IL-6和 TNF-a水平的影响

图5 虾青素对ZEN诱导的IPEC-J2细胞ATF6、CHOP. BAX、BcI-2和BcI-XL基因 mRNA表达的影响

ZEN抑制细胞增殖和降低细胞活性是其细胞毒性的主要表现。ZEN抑制细胞增殖、降低细胞活性与氧化损伤有关。大量研究表明，抗氧化物质具有对抗ZEN对细胞增殖的抑制和对细胞活性的降低的作用效果。本试验表明, ZEN能显著抑制IPEC-J2细胞的生长和细胞活力,这与研究结果类似, ZEN能够显著降低小鼠睾丸间质细胞的细胞活力,且呈剂量依赖性。同时,本试验结果也证明作为抗氧化物质的虾青素能够改善ZEN所致的IPEC-J2细胞生长抑制和细胞活力降低。

LDH存在于细胞质中，当细胞结构破坏时LDH就被释放到细胞外,其释放量与细胞损伤的程度呈正相关,因而监测血液或细胞培养液中LDH水平,就能反映细胞的损伤程度。研究表明, ZEN作用于肠道上皮细胞会导致细胞损伤和细胞凋亡, 使LDH大量释放到细胞外。本研究结果也表明, ZEN能显著增加IPEC-J2细胞培养上清液中LDH水平。同时本研究还发现，5、10和20 μmol/L的虾青素均能显著降低ZEN所致的IPEC-J2细胞培养液中LDH水平,进一步说明虾青素在一定程度上能够缓解ZEN对IPEC-J2细胞的毒性作用。类似的研究报道，具 有抗氧化特性的原青花素和有机硒也都能有效降低ZEN所致的动物肠上皮细胞外LDH水平。

氧化损伤是ZEN发挥毒性作用的主要途径之一,ZEN能引发生物膜中多不饱和脂肪酸的脂质过氧化作用,而脂质过氧化作用最终能导致很多脂类分解产物的形成,并引起细胞代谢及功能障碍。ZEN能促进活性氧的产生并降低抗氧化酶的活性,导致猪肠.上皮细胞的氧化应激进而诱发炎症反应,并增加IL-1、IL-2、IL-6和TNF-a等促炎因子的表达,抑制儿L-4和IL-10等抑炎因子的表达。大量研究表明,具有抗氧化特性的物质均能够有效缓解ZEN对机体和细胞的氧化损伤作用,进而缓解其毒性作用。例如,原花青素可减轻ZEN诱导的TM4和MODEK细胞的氧化损伤与细胞凋亡;有机硒、槲皮素或番红花也可通过降低活性氧水平,抑制内质网应激通路来减轻ZEN诱导的细胞损伤和炎症反应,进而下调促炎因子表达，上调抑炎因子表达。本试验结果也表明,不同浓度的虾青素均能对抗ZEN诱导的IPEC-J2细胞SOD、GSH-Px、T-AOC和MDA水 平的改变,这说明虾青素能够提高ZEN诱导的IPEC-J2细胞抗氧化功能的降低。

本试验还表明,不同浓度的虾青素均能够对抗ZEN诱导的IL-1、IL-6和TNF-a等 促炎因子mRNA表达升高以及IL-4等抑炎因子mRNA表达降低,说明虾青素通过减轻ZEN诱导的IPEC-J2的氧化应激,抑制其炎症反应,并下调了促炎因子的表达，上调了抑炎因子的表达。

ATF6信号通路是内质网应激时未折叠蛋白反应信号通路中重要的组成部分,ATF6和CHOP是该通路的关键蛋白,BAX、Bcl-2和BcI-XL则是该通路下游的效应蛋白。ATF6通过诱导CHOP基因表达,能够诱导BAX基因表达,并抑制Bcl-2和Bcl-XL基因表达。本研究结果表明, ZEN通过上调IPEC-J2细胞ATF6、CHOP和BAX基因表达，下调BcI-2和Bcl-XL基因表达,说明ZEN通过内质网应激通路诱发细胞凋亡发挥其对IPEC-J2细胞的毒性作用。研究表明,有机硒、原花青素、槲皮素等抗氧物质能够缓解ZEN诱导的细胞凋亡,改变caspase-3、caspase-9、BAX、Bcl-2和Bcl-XL 等凋亡相关基因的表达水平。本研究结果也表明,不同浓度的虾青素均能够降低ZEN诱导的IPEC-J2细胞ATF6、CHOP和BAX基因mRNA表达水平以及BAX/Bcl-2比值的升高,能够降低ZEN诱导的IPEC-J2细胞Bcl-2和Bcl-XL基因mRNA表达水平的降低,说明虾青素能够缓解ZEN通过内质网应激诱导的IPEC-J2细胞凋亡的发生。虾青素可能是通过抑制内质网应激诱导的细胞凋亡途径,减少氧化应激和ZEN诱导的细胞凋亡，从而对抗ZEN诱导的IPEC-J2细胞的损伤作用。

综上,本研究结果显示,虾青素能够缓解ZEN诱导的IPEC-J2细胞损伤,具有潜在的应用前景。