1.2方法

1.2.1螺旋藻分离蛋白的提取

准确称取2.0 g螺旋藻超微粉碎粉,加入适量去离子水,搅拌均匀,采用1 mol/L的NaOH溶液调节体系pH至9.0 ,水浴搅拌, 8 500 r/min离心15 min,收集上清液,用1 mol/L的HCI溶液调节体系pH至4.5 ,室温静置2h ,8 500 r/min离心15 min,取沉淀,加入少量蒸馏水溶解,调节pH至7.0 ,冷冻干燥,得螺旋藻分离蛋白,于-20℃贮藏备用。

1.2.2单因素试验

固定料液比1:20 ( g/mL ) , 提取时间2 h ,提取温度45 °C ,体系pH 9.0 ,分别考察料液比[1:10 , 1:20, 1:30 , 1:40 , 1:50 ( g/mL)]、提取时间(0.5, 1.0, 1.5, 2.0, 2.5h)、体系pH( 7.0 , 8.0, 9.0, 10.0 , 11.0)和提取温度(35, 40, 45, 50 , 55 ℃)对螺旋藻分离蛋白提取量的影响。

1.2.3正交试验

基于单因素试验,以螺旋藻分离蛋白提取量为评价指标,根据Lg ( 34 )表设计正交试验,进一步确定螺旋藻分离蛋白的最佳提取

工艺。

1.2.4螺旋藻分离蛋白提取量测定

采用考马斯亮蓝G250比色法。

1.2.5螺旋藻分离蛋白的理化性质分析

( 1 )粒径和zeta电位:用超纯水配制0.1 mg/ml螺旋藻分离蛋白分散液,采用纳米粒度仪测定体系的颗粒大小及zeta电位,并与大豆分离蛋白、花生分离蛋白和鸡蛋清白蛋白进行对比分析。

( 2 )表面疏水性:参照赵巧丽的方法。

( 3 )游离巯基含量:用pH 8.0的Tris-甘氨酸缓冲液(含0.086 mol/L Tris , 0.09 mol/L甘氨酸, 4 mmol/L乙=胺四乙酸)将螺旋藻分离蛋白稀释至2 mg/mL ,随后,取4.5 mL稀释的蛋白溶液,加入50 μL质量浓度为4 mg/mL的DNTB试剂,混匀, 30 °C孵育30 min,测定412 nm处吸光度,按式(1 )计算游离巯基含量。 

( 4 ) SDS-PAGE凝胶电泳:配制1 mg/ml螺旋藻分离蛋白分散液,将其与5x.上样缓冲液混合, 100℃水浴5 min,冷却,参照赵巧丽等13的方法进行SDS-PAGE凝胶电泳分析。

(5)色泽:采用分光测色仪测定螺旋藻分离蛋白的颜色值L、a和b* ,并与大豆分离蛋白、花生分离蛋白和鸡蛋清白蛋白进行对比分析,按式(2)计算色差。

1.2.6螺旋藻分离蛋白的功能特性分析

( 1 )溶解性:参照赵巧等13的方法。

( 2)持水力和持油力:参照赵巧丽的方法。

( 3 )起泡能力和泡沫稳定性:参照赵巧丽的方法。

(4 )乳化活性指数和乳化稳定性指数:参照赵巧丽的方法。

1.2.7数据处理

所有试验数据均表示为“平均值t标准差”, 使用SPSS 25.0软件对数据结果进行方差分析, P <0.05为差异显著。

2.1螺旋藻分离蛋白的提取工艺优化

2.1.1单因素试验

由1(a)可知,随着料液比的增加,螺旋藻分离蛋白提取量不断增大,并在料液比为1:20 ( g/mL )时达到最大值。这可能是于料液比过小导致物料较为黏稠,使螺旋藻分离蛋白的溶出受阻,适当增大料液比有助于蛋白质的溶出和扩散。当料液比> 1:20( g/mL )时,螺旋藻分离蛋白提取量逐渐降低,这可能是因为较大的料液比对完全溶出的蛋白具有一定的稀释作用。此外,料液比较大会使得相同时间内体系升温较慢,且会影响后续的冻干效率。因此,选取1:20 ( g/mL )为螺旋藻分离蛋白提取的最佳料液比。由1(b)可知,随着提取时间的延长,螺旋藻分离蛋白提取量呈先增加后降低趋势,当提取时间为1.0 h时,螺旋藻分离蛋白提取量最大。这可能是因为提取时间过短,螺旋藻分离蛋白的溶出不完全,当提取时间＞1.0 h时,由于加热时间的延长可能会引起蛋白质变性或降解,从而导致提取量降低。因此,选取螺旋藻分离蛋白的最佳提取时间为1.0 h。由于1 (c)可知,螺旋藻分离蛋白提取量随着体系pH的增加呈先增大后减小趋势,并在pH 8.0时达到最大值。适当的碱性环境有利于浸提过程中将蛋白质从螺旋藻细胞中溶出,但当体系pH过高时,强碱环境可能会导致蛋白质变性或聚集,进而降低其提取量。因此,选取螺旋藻分离蛋白提取的最佳体系pH为8.0。

由1 (d )可知,当提取温度<45℃时,螺旋藻分离蛋白提取量随着提取温度的升高不断增大,并在提取温度为45℃时达到最大提取量。这可能是因为适当地升高温度有利于促进分子间运动,加快蛋白质的扩散速度,使其更易于从螺旋藻细胞中溶出。当温度继续上升时,螺旋藻分离蛋白提取量开始下降,这是因为过高的温度会破坏蛋白质的结构和性质,导致蛋白质变性和降解。因此,选取螺旋藻分离蛋白的最佳提取温度为45℃。

图1 各因素对螺旋藻分离蛋白提取量的影响

2.1.2正交试验

在单因素试验基础上,进一步采用正交试验对螺旋藻分 离蛋白的提取工艺进行优化,正交试验因素水平见表1 ,试验设计及结果见表2。由表2可知,料液比对螺旋藻分离蛋白提取量影响最大,体系pH和提取温度次之。螺旋藻分离蛋白的最佳提取工艺条件为料液比1:20 ( g/mL)、提取时间1.0 h、体系pH 8.0、提取温度40℃。由表3可知,料液比、体系pH和提取温度对螺旋藻分离蛋白提取量影响显著(P<0.05)。在最佳工艺条件下进行3次验证实验，得到螺旋藻分离蛋白提取量为( 280.36+2.18 ) mg/g ,均高于表2中任一试验组结果,表明所得的最佳I艺参数可靠。此外,最佳I艺条件下的螺旋藻分离蛋白提取量均显著高于磁场辅助提取、高速匀浆提取和以NaCI为促进剂提取藻蓝蛋白12]的, 进一步说明碱溶酸沉法是一种提取效果相对较好的植物蛋白制备方法。

表1 正交试验因素水平

表2 正交试验结果

2.2螺旋藻分离蛋白的理化性质

2.2.1粒径及zeta电位

图2 (a)可知,大豆分离蛋白的粒径较大,花生分离蛋白和鸡蛋清白蛋白的次之。相比之下,螺旋藻分离蛋白的粒径较小，仅为841.07 nm。zeta电位与纳米分散体系的稳定性以及聚集行为有关,电位绝对值越高,粒子之间的排斥力越大,因此体系越稳定,而较低的zeta电位则可能导致粒子聚集或絮凝。由图2 (b )可知, 4种蛋白质的zeta电位均为负值，其中 ,螺旋藻分离蛋白的绝对电位值最大,次为鸡蛋清白蛋白,大豆分离蛋白的绝对电位值最小,说明螺旋藻分离蛋白表面的有效电荷量较多,体系稳定性较好。

图2 不同蛋白的粒径和zeta电位

2.2.2表面疏水性和游离巯基含量

图3 (a)可知,鸡蛋清白蛋白的表面疏水性最高,螺旋藻分离蛋白的表面疏水性略低于鸡蛋清白蛋白,但 显著高于花生分离蛋白和大豆分离蛋白。表明不同来源蛋白质的表面疏水性差异较大,可能与蛋白质中不同的氦基酸组成、空间构象和表面疏水基团含量有关。

图3 (b)可知,螺旋藻分离蛋白的游离巯基含量最高,花生分离蛋白和大豆分离蛋白的次之,而鸡蛋清白蛋白的游离疏基含量最低。综上,螺旋藻分离蛋白的活性相对较高,结构更为紧凑,其可能具有更加丰富的生理活性。

图3 不同蛋白的表面疏水性和游离巯基含量

2.2.3 SDS-PAGE凝胶电泳分析

由图4可知,不同蛋白质的亚基组成差异较大。大豆分离蛋白的主要成分为7S球蛋白和11S球蛋白, 7S球蛋白主要含有3种分子量的蛋白亚基,分别为a'、a和,主要分布在43~97 kDa , 11S球蛋白主要含有AS和BS亚基,分布在35 , 20 kDa附近,与金银霜等的结论相符。花生分离蛋白主要含有4种分子量的蛋白亚基,分别位于21 , 31-43 , 65 kDa附近,与王化田等[16]的研究结果类似。鸡蛋清白蛋白的主要亚基条带为溶菌酶( 14 kDa)、卵清蛋白( 31-45 kDa )和卵转铁蛋白( 66 kDa)。相比之下,螺旋藻分离蛋白的分子量较小,蛋白亚基主要分布在15 kDa左右,与关瑞等171的分子份布基本一致。

图4 不同蛋白的凝胶电泳图

2.2.4颜色

采用试验方法提取的螺旋藻分离蛋白外观呈墨绿色。通常,蛋白质的外观色泽与其色素含量、纯度和固有特性有关。由表4可知,螺旋藻分离蛋白的亮度值最小,颜色最暗,且与其他3种蛋白颜色差异较大,这可能与螺旋藻分离蛋白中稳定存在的藻蓝素有关。相比

之下,鸡蛋清白蛋白的亮度值较高,颜色偏黄,而大豆分离蛋白和花生分离蛋白的外观偏白,颜色值较为接近。

表4 不同蛋白的色度值和色差

2.2.5圆二色谱分析

图5 (a)可知,所有样品在207~210 nm处有一个负峰,为蛋白质中典型的a-螺旋结构,不同蛋白质的吸收峰强度不同,表明不同蛋白质的二级结构组成存在较大差异。通过CDNN软件分析圆二色谱图数据,得到不同蛋白质的a-螺旋、β-转角、 β-折叠和无规卷曲含量。图5(b)可知, 4种蛋白质的β-转角和无规卷曲含量较为接近,基本保持在6%和18%左右。此外,大豆分离蛋白和花生分离蛋白的二级结构组成较为相近,其折叠含量较高。相比之下,鸡蛋清白蛋白和螺旋藻分离蛋白的β-折叠含量有所降低，而c-螺旋含量显著升高。白质的a螺旋含量与其结构稳定性有关,通常a-螺旋含量越高,白质的稳定性越好。综上,螺旋藻分离蛋白具有相对较好的稳定性和结构完整性。

图5 不同蛋白的圆二色谱和二级结构组成

2.2.6荧光光谱分析

图6可知,大豆分离蛋白、花生分离蛋白、鸡蛋清白蛋白和螺旋藻分离蛋白的最大荧光吸收峰分别位于335 , 326 , 335 , 336 nm。当最大吸收峰<330 nm时,色氨酸处于蛋白质的内部非极性区,由此说明,除花生分离蛋白外,其他3种蛋白质分子在溶液中的暴露程度较大，色氨酸残基更趋向于从蛋白质分子内部的疏水环境向表面极性较强的环境移动。此外, 4种蛋白质的荧光强度相差较大,其中鸡蛋清白蛋白的荧光强度较高,螺旋藻分离蛋白的次之,而大豆分离蛋白和花生分离蛋白的较低,可能是由于不同蛋白质分子表面所暴露的色氨酸含量不同。通常,荧光强度越大,蛋白质分子表面暴露的色氨酸含量越多。此外,荧光强度还可以反映蛋白质的表面疏水性,蛋白质的荧光强度越高,其表面疏水性也越强，与试验结果保持一致。

图6 不同蛋白的荧光光谱图

2.3螺旋藻分离蛋白的功能特性分析

2.3.1溶解性

由图7 (a)可知,鸡蛋清白蛋白的溶解性较好,螺旋藻分离蛋白的次之,花生分离蛋白和大豆分离蛋白(尤其是大豆分离蛋白)的溶解性较差,可能是由于大豆分离蛋白和花生分离蛋白的粒径较大,与水分子的相互作用较弱,导致蛋白分子间发生聚集。

2.3.2持水力和持油力

图7 (b)可知,大豆分离蛋白的持水力较高,花生分离蛋白和螺旋藻分离蛋白的次之, 鸡蛋清白蛋白的持水力最低。王化田等研究发现,大豆分离蛋白的持水力高于花生分离蛋白和豌豆分离蛋白。蛋白质的氨基酸组成对其持水力起着关键作用,氨基酸中的极性残基(如羟基、羧基、基等)能够与水分子形成氢键或离子键,从而增加蛋白质的水合能力和持水性。通常,含有大量极性氨基酸的蛋白质往往具有较高的持水性。此外,大豆分离蛋白和花生分离蛋白的颗粒尺寸较大,在水溶液中的溶解性较低,这可能也是造成其持水力相对较高的原因之一。

图7 (c)可知,鸡蛋清白蛋白的持油性较好,螺旋藻分离蛋白的次之,大豆分离蛋白和花生分离蛋白的较差。有研究指出，大豆分离蛋白和花生分离蛋白的持油力较低，且均显著低于牡丹籽蛋白的。这可能是因为蛋白质的持油性与其表面疏水基团密切相关,当蛋白质具有较多的表面疏水基团时,可使其更有效地与油脂结合, 进而赋予其较高的持油力。

图7 不同蛋白的溶解性、冰力和持油力

2.3.3起泡性和泡沫稳定性

在食品加工中,蛋白质的起泡能力能够使面团更加松软、蓬松,而泡沫稳定性则能保持食品的体积和形状[20]。邮8(a)可知，螺旋藻分离蛋白呈现较好的起泡能力和泡沫稳定性。此外,大豆分离蛋白也呈现相对较好的起泡能力，与王化田、的研究结果类似，但其泡沫稳定性较差,消泡速度较快。这可能是因为螺旋藻分离蛋白的a-螺旋含量较高,同时具有良好的灵活性和稳定性,从而使其呈现相对较好的起泡特性。

图8 不同蛋白的起泡特性和乳化能力

2.3.4乳化能力

由图8(b)可知,螺旋藻分离蛋白的乳化活性指数和乳液稳定性指数均最高,可能是由于螺旋藻分离蛋白的粒径较小、主要亚基分子量较低、水溶性较好,使其能够更快迁移至油一-水两相界面 ,形成稳定性较好的黏弹性界面膜。此外,鸡蛋清白蛋白也呈现相对较好的乳化活性指数和乳液稳定性指数。相比之下,大豆分离蛋白和花生分离蛋白的乳化活性指数和乳液稳定性指数较低,这主要归因于二者较大的颗粒尺寸和较差的水溶性,不利于其在油一水界面的有效吸附 ，导致体系中的油滴容易发生聚集和合并,进而降低了体系的稳定性。

螺旋藻分离蛋白的最佳提取工艺参数为料液比1:20 ( g/mL)、提取时间1.0 h、体系pH 8.0、提取温度40。C ,此条件下螺旋藻分离蛋白提取量达到280.36 mg/g。试验所得螺旋藻分离蛋白外观呈墨绿色,主要亚基分子量保持在15 kDa左右,表面疏水性为330.49 ,游离巯基含量为20.51 μmol/g。与大豆分离蛋白和花生分离蛋白相比,螺旋藻分离蛋白具有较好的溶解性、持油力、起泡性和乳化能力。与鸡蛋清白蛋白相比,螺旋藻分离蛋白具有较好的持水力、起泡性和乳化能力,可视作一种功能性质相对较好的天然源植物蛋白,在食品乳液体系构建、乳液泡沫体系开发等领域具有较好的开发利用前景。今后将进一步对螺旋藻分离蛋白的功能特性进行全面研究，以期扩大其在食品乳液体系中的应用。