化肥是发展集约化农业最广泛采用的农业方式之一, 但是工业农化产品的过度使用导致了土壤和水体富营养化以及大规模生态退化等一系列环境问题(Garcia-Gonzalez and Sommerfeld, 2016)。微藻是微小的单细胞或丝状生物,普遍存在于所有水生和陆地环境,其含有多种植物生长促进物质,如多糖、脂类、蛋白质和植物激素等,具有生物刺激素和生物肥料的特性(Ma et al., 2022)。生物刺激素和生物肥料被认为是合成产品(如化肥，农药和生长调节剂)的经济环保的替代品,在提高土壤肥力、种子萌发、植物生长和产量以及植物抗逆性方面具有重要作用(Renuka et al., 2018)。因此,在农业种植过程中,科学合理的利用微藻提取物,有助于农作物提质增产。
近年来,微藻活性物质的开发与功能的鉴定受到各界学者专家的关注。在活性物质提取方法如物理提取法、化学提取法和生物提取法方面也有一定的技术突破。微藻源生物刺激素兼有功能性肥料与农药两种属性，且能促进作物的代谢与生长并提高作物的营养吸收能力与抗逆性,同时改善土壤条件。如Coppens等(2016)发现 与化学肥料相比,海藻能提高番茄果实的糖分和类胡萝卜素含量,从而改善番茄果实品质;刘淑芳等(2016)证明了蛋白核小球藻、四尾栅藻和卷曲鱼腥藻的提取液对黄瓜和番茄苗的根长、须根数和茎长均有不同程度的促进作用。由于微藻细胞内组分的多样性,不同藻种以及不同提取方法产出的活性物质的种类和活性存在一定的差异。微藻在农业上的有益特性归功于其细胞内含物的存在,因此,有必要探究多种藻种在不同的提取手段下的提取物的生物刺激作用。
谷子是平衡人类膳食营养和建设可持续农业的生态作物之一, 其营养价值高,含有丰富的蛋白质、不饱和脂肪酸和维生素,饲草粗蛋白含高,同时谷子还具有耐旱、耐瘠薄、强稳产性和广适应性等优势。由于这些突出的特点,谷子被认为是平衡人类膳食营养和建设可持续农业的生态作物。
小球藻、螺旋藻、雨生红球藻和莱茵衣藻等是目前主要的人工养殖和商业化应用,且具有广泛研究价值的微藻品种。本研究使用反复冻融法和超声波破碎法获得小球藻、螺旋藻、雨生红球藻和莱茵衣藻四种微藻的水提液和醇提液并对谷子进行灌溉处理,旨在研究不同提取方法下四种微藻提取液对谷子生长和生化组分的影响和差异。
微藻提取液对谷子根长、长和鲜重的影响
利用测量根长与茎长的方法比较了不同微藻提取液处理下谷子在第4天和第30天的生长情况。结果发现,谷子在发芽第4天时,茎长和根长在四种微藻水提液和醇提液处理下与对照组相比没有显著影响(图1A;图1B)。利用埃式小球藻和极大螺旋藻水提液(S1和S3)处理谷子幼苗后，谷子幼苗的根长分别显著提高 了123.53%和70.59%(图1A) ,同时茎长在埃式小球藻、极大螺旋藻和雨生红球藻醇提液(S1,S3和S4)处理后分别显著提高了83.33% , 150.00%和122.22%(图1B)。
图1 四种微藻提取液对谷子根长和茎长的影响
注:图A和图B以及图C和图D为发芽第4天和30天时,埃式小球藻(S1),莱茵衣藻(S2),极大螺旋藻(S3)和雨生红球藻(S4)水提液和醇提液对谷子根长和茎长的影响,无菌水为对照(CK, control check)。同字母表示组间存在显著性差异(P <0.05)在第30天时，与对照组相比,埃式小球藻和极大螺旋藻水提液(S1和S3)显著提高了谷子的根长和茎长,根长分别提高了60.00%和62.67% ,茎长分别提高了87.18%和45.13%(图1C;图1D)。同时，与对照组相比,埃式小球藻和极大螺旋藻水提液(S1和S3)以及雨生红球藻醇提液(S4)处理后的谷子鲜重显著提高了167.21%、134.43%和122.95%(图2) ,说明微藻水提液对谷子生长有促进作用。
图2 四种微藻提取液对谷子鲜重的影响
微藻提取液对谷子根系活力和叶绿素含量的影响
比较了不同微藻提取液处理下谷子在第30天的根系活力和叶绿素含量。基于标准曲线公式: y=0.0056x+0.0218(R2=0.9993) ,得出不同处理下谷子根系活力值(图3A)。与对照组相比,谷子的根系活力在埃式小球藻水提液和醇提液(S1)的作用下分别提高了195.5%和204.5% ,在极大螺旋藻水提液和醇提液(S3)的作用下分别提高了136.4%和113.6% ,同时雨生红球藻醇提液(S4)处理后的谷子的根系活力提高了114.5%。然而,与对照组相比,莱茵衣藻水提液和醇提液(S2)对谷子的根系活力没有显著影响(图3B)。
图3 四种微藻提取液对谷子幼苗根系活力的影响
注: A是根系活力标准曲线公式; B是四种微藻提取液对谷子幼苗根系活力的影响,无菌水为对照(CK)。不同字母表示组间存在显著性差异
埃式小球藻和极大螺旋藻水提液和醇提液(S1和S3)显著提高谷子叶片叶绿素总量,且埃式小球藻水提液(S1)处理后的谷子叶片的叶绿素总量最高(18μg/mL) ,比对照组提高了117.60%(图4A)。四种微藻水提液和醇提液对谷子叶片的叶绿素a和叶绿素b含量的影响呈现相同的趋势。谷子叶片的叶绿素a和叶绿素b含量在埃式小球藻水提液(S1)处理后均大于其他处理,且与对照相比分别提高了72.90%和268.68% ,而莱茵衣藻水提液和醇提液(S2)没有显著增加谷子叶片的叶绿素a和叶绿素b的含量(图4B;图4C)。同时,与对照组相比,埃式小球藻和极大螺旋藻水提液(S1和S3)的谷子叶片的叶绿素b/a值显著提高了113.65%和87.03%(图4D)。
图4 四种微藻提取液对谷子的叶绿素含量的影响
微藻提取物对谷子叶片可溶性糖和蛋白质含量过氧化物酶活性的影响
利用蒽酮硫酸法、BCA蛋 白定量法和邻苯三酚比色法分别测定不同微藻提取物处理下谷子叶片在第30天的可溶性糖和蛋白质含量以及过氧化物酶活性。与对照组相比,埃式小球藻水提液(S1)和极大螺旋藻醇提液(S3)处理后的谷子的可溶性糖含量没有显著变化,而其他处理均显著增加,其中埃式小球藻(S1)醇提液处理后的谷子的可溶性糖含量提高了476.64% (图5A)。此外,除了莱茵衣藻(S2)和极大螺旋藻(S3)醇提液以外，四种微藻水提液和醇提液处理与对照相比均提高了谷子的蛋白质含量,其中雨生红球藻(S4)水提液处理提高了150.00% (图5B)。
图5 四种微藻提取液对谷子叶片的可溶性糖和蛋白质含量的影响
注:图A和图B是四种微藻提取液对谷子幼苗可溶性糖和蛋白含量的影响;埃式小球藻(S1),莱茵衣藻(S2),极大螺旋藻(S3)和雨生红球藻(S4),无菌水为对照(CK)。桐字母表示组间存在显著性差异(P <0.05)
与对照组相比,极大螺旋藻(S3)和雨生红球藻(S4)水提液以及莱茵衣藻(S2)醇提液均显著提高了谷子叶片的过氧化物酶活性,其中莱茵衣藻(S2)醇提液处理后的谷子叶片的过氧化物酶活性最高,提高了177.03% (图6) ,结果说明极大螺旋藻和雨生红球藻水提液及莱茵衣藻的醇提液对谷子叶片的过氧化物酶的产生有促进作用。
图6 四种微澡提取液对谷子叶过氧化物酶活性的影响
微藻生物量和提取物可以促进谷物、园艺和蔬菜作物的种子萌发、作物生长和生产。本研究研究了埃式小球藻、莱茵衣藻、极大螺旋藻和雨生红球藻的水提液和醇提液处理后谷子在第4和30天的生长情况。结果表明,埃式小球藻和极大螺旋藻水提液和醇提液均促进了谷子在第4和30天的根长和茎长,雨生红球藻醇提液也表现出相同的效果(图1)。
本试验中,极大螺旋藻和雨生红球藻醇提液对第4和30天谷子的茎生长的促进作用大于水提液,这可能是由于这两种藻对醇提法更为敏感,可以释放更多的活性物质。此外,对第30天谷子的生长有促进作用的微藻处理在茎的生长上均表现出比根伸长更好的效果,且谷子在第4天的根长以及第30天的茎长均在埃式小球藻处理下表现最好。同时,谷子在第30天的鲜重表明埃式小球藻水提液、极大螺旋藻水提液和醇提液以及雨生红球藻醇提液促进了谷子的生长和生物量积累(图2)。一项分别采用人工模拟和自然土壤培育藜麦的生长试验也发现小球藻灌溉处理促进了藜麦的生长和干物质积累。微藻提取物对植物生长的调节和刺激作用可能是由于微藻中具有生长刺激作用的生物活性物质的存在,四种微藻在水提法和醇提法后的提取物对植物的作用差异可能是由于微藻所含活性物质的不同以及提取工艺所萃取的物质种类和活性的差异。
植物获取营养的部位主要由根系承担,根系活力决定了植物吸收养分的效率。本研究表明埃式小球藻和极大螺旋藻的水提液和醇提液以及雨生红球藻的醇提液均提高了谷子的根系活力(图3)。Barone等(2018)发现栅藻和小球藻提取物处理甜菜后,在形态水平上，处理苗的总根长、细根长和根尖数均高于未处理苗,而在分子水平上,微藻提取物上调了一些与不同生物途径和过程相关的基因,包括初级和次级代谢和细胞内运输,尤其是与营养获取相关的根系性状。兰彪等(2022)通过土培、沙培、水培进行水稻秧苗试验,发现在不同培养基质下使用微藻的稻苗的根的总表面积和根的平均直径均显著提升,微藻可以通过增加根的总表面积和粗度,提高根系对营养物质和水分的吸收能力,从而达到壮苗增产的效果。这些处理的生长状况优于未处理苗可能归因于生长素、细胞分裂素和赤霉素等促根激素的存在。
此外,埃式小球藻和极大螺旋藻水提液和醇提液均促进了谷子叶绿素的合成,且埃式小球藻的处理效果最好,同时提取液对叶绿素b合成的促进效果大于叶绿素a (图4)。叶绿素是存在于植物体内的绿色色素,是决定光合作用能力重要组成部分,而光合作用又与植物的生长发育有关。苜蓿的促生研究也表明小球藻和衣藻的灌溉处理可显著提高植物的色素含量。因此,微藻提取物可以提高谷子的根部特性包括根生长和活力,并且促进叶片的叶绿素合成,这些有益特性可以增强谷子的养分摄取能力并促进光合作用,从而促进生长和物质积累。
进一步的品质分析表明莱茵衣藻、极大螺旋藻和雨生红球藻水提液以及埃式小球藻、莱茵衣藻和雨生红球藻醇提液促进了谷子叶舸溶性糖的合成,同时除了莱茵衣藻和极大螺旋藻醇提液外,微藻提取液也均促进了可溶性蛋白的积累(图5)。小球藻的土壤应用也被证明可以提高生菜的可溶性碳水化合物、可溶性蛋白质和总游离氨基酸的含量,因为在土壤中添加藻类可以改善植物的营养状况。本研究发现不同微藻提取物对谷子合成可溶性糖和蛋白的影响存在差异,其中埃式小球藻醇提液对可溶性糖合成的促进效果最好。同时极大螺旋藻和雨生红球藻水提液以及莱茵衣藻醇提液提高了谷子叶片的过氧化物酶活性(图6) ,这可能有助于谷子更好地应对外界的胁迫因素。学者何善生的研究结果也表明螺旋藻提取物增强过氧化物酶和超氧化物歧化酶活性,同时,能使苹果片中蛋白、抗坏血酸、总酚等指标的含量保持在较高水平,在水果运输过程中增加保鲜时限。
本研究评估了四种微藻的水提液和醇提液对谷子生长和生化组分的影响,微藻提取液提高了谷子的生长、根系活性、叶绿素、可溶性糖和蛋白含量以及过氧化物酶活性, 总体看来埃式小球藻的促生效果最好。可是，同一藻种在不同的提取方法下对谷子的影响存在显著差异,这可能是由于藻细胞内活性物质以及提取方式的萃取效率的不同(Ronga et al, 2019)。因此,针对不同的藻种要选用合适的提取方式获取目的产物,在进一步的生产应用时,也要考虑到不同藻种提取物的生长调节作用的差异,从而更高效地发挥微藻刺激剂的效益。
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