1.1主要材料、试剂与仪器

NIH-3T3细胞,购自国家实验细胞资源共享服务平台(北京总部)。昆明小鼠30只,雌性, 6周龄,体重(18.0+2.0) g,购自广东省医学实验动物中心。极地雪藻提取物(5 g),佛山市康伲爱伦生物技术有限公司;DMEM高糖培养基(500 mL)、胎牛血清(FBS, 500 mL)、磷酸缓冲溶液(PBS, 500 mL), Gibco公司;免抗IL- 1抗体(100L)、羊抗兔抗体(100μL) , Abcam公司;噻唑蓝(MTT), 1 g,北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司;MCO-AC型二氧化碳培养箱,日本SANYO公司;SW-CJ-2FD超净工作台,苏州安泰空气技术有限公司;Olympus IX71倒置显微镜,日本奥林巴斯公司;Spectramax i3多功能酶标仪,美国Molecular Devices公司;UVB灯管(40 W)，飞利浦公司。

1.2实验方法

1.2.1细胞培养

NIH-3T3细胞长满培养瓶70% -80%时进行细胞传代。100μl 细胞悬液(4x 104个细胞/mL)均匀接种于96孔板中,孔板于37°C、5%CO2培养箱培养24 h。

1.2.2极地雪藻提取物毒性测试

细胞种板后24 h,小心吸取原有培养基,将100μL不同质量浓度的含药培养基加至不同组分(0.01- 1 g/L),每组6个复孔,空白组加等量的培养基。培养48 h后,弃去培养基,加入100μL MTT溶液(0.5 g/L) , 37℃孵育4 h, DMSO溶解甲瓒,酶标仪570 nm测定光密度值。

1.2.3极地雪藻提取物氧化修复实验

细胞种板培养24h后，小心吸取原有培养基, PBS清洗3次加入400μmol/L过氧化氢损伤2h, PBS清洗3次后,将100μL的不同质量浓度的含药培养基加至不同组分,每组6个复孔。分组如下:空白组、模型组、低质量浓度组(0.01g/L)、中质量浓度组(0.1g/L)、高质量浓度组(1g/L),其中空白组和模型组加等量的培养基。培养48 h后,弃去培养基,加入100μL MTT溶液(0.5 g/L), 37℃孵育4 h,DMSO溶解甲瓒,酶标仪570 nm测定光密度值。

1.2.4动物试验与实验分组

小鼠在7天适应性培养后,随机分5组,每组6只,分别为空白组,模型组,极地雪藻提取物不同质量浓度组(2,10和50g/L)。小鼠用剃须刀剃长毛, 2%的硫化钠脱毛,得到3cmx3 cm剃毛区。自制紫外辐射装置,灯管距离地面20 cm,空白组不进行照射,蜍组每天照射2 h UVB (灯管辐照剂量0.9 W/m2) ,模型组照射后涂抹对应溶剂(蒸馏水) ,药物组照射后涂抹药物,织均匀涂抹100uL药物。实验周期28天最后一天照射结束后,处死小鼠并取背部皮肤,于-80°C保存进行后续实验。

1.2.5 H&E染色

4%多聚甲醛固定背部皮肤组织,常规脱水后,石蜡包埋,切成4μm小块。组织于二甲苯浸泡脱蜡后,依次置于95%, 85%和70%乙醇中各浸泡5 min,苏木素伊红染色,二甲苯透明,中性胶封片。切片于显微镜下观察并随机选取视野拍照。

1.2.6 Masson染色

常规步骤染色,操作如下:组织石蜡切片后，浸泡于二甲苯中,梯度无水乙醇脱水。Weigert铁苏木 素染色10 min,蒸馏水冲洗;1%盐酸酒精分化,蒸馏水冲洗;Masson丽春红酸性品红液染色5 ~ 10 min;1%磷钼酸处理1 min;不经水洗苯胺蓝复染5 min;1%冰醋酸处理1min;95%无水乙醇脱水多次;二甲苯透明,中性胶封片。染色后, 胶原纤维显蓝色,细胞浆与红细胞呈绝,细胞核呈蓝褐色。

1.2.7免疫组化染色(IHC染色)

将4um石蜡切片经过二甲苯脱蜡,梯度无水乙醇脱水, 3%过氧化氢孵育10 min后, PBS冲洗。血清封闭后，于IL-1、IL-6、 TNF-a抗体(抗体与蒸馏水稀释体积比为1 : 100)中4°C孵育过夜,二抗抗兔IgG酶标抗体37℃孵育。辣根过氧化酶孵育后, DAB染色,苏木素复染。制片后在200倍显微镜下随机选取视野拍照。

1.3数据处理

使用Image J软件处理免疫组化染色图像,计算其光密度。用SPSS 11.0软件对数据进行方差分析, P<0.05具有统计学意义。

2.1极地雪藻提取物的细胞毒性

通过MTT法测试NIH-3T3细胞在不同质量浓度提取物下的细胞活力,研究极地雪藻提取物对NIH-3T3的细胞毒性。实验数据表明(图1) ,极地雪藻提取物在质量浓度1 g/L及以下时NIH-3T3细胞存活率均在98%及以上,与空白组相比没有显著性差异(P>0.05) ,对NIH-3T3细胞无明显的毒性,故选择此质量浓度及以下浓度进行下一步实验。

图1 极地雪藻提取物细胞毒性测试

2.2极地雪藻提取物细胞修复作用

目前诱导氧化应激的细胞模型有多种,其中常用的为双氧水刺激诱导细胞氧化应激损伤。通过在正常培养的细胞中加入400μmol/L的过氧化氢建立氧化压力环境,建立氧化应激损伤模型。通过对比空白组、模型组和给药组的细胞活力大小,研究极地雪藻的氧化应激保护作用(图2)。由图2可知，模型组与空白组相比,过氧化氢的处理显著抑制了NIH-3T3细胞活性,细胞活性下降为原来的60%(#表示损伤组细胞存活率与空白组细胞存活率相比, P <0.001) ;通过给药组与模型组对比，在给予不同质量浓度的极地雪藻提取物处理后, NIH-3T3细胞存活率显著增加,质量浓度为0.01, 0.1和1 g/L的极地雪藻提取物作用下,细胞活力分别提高到70%, 75%和80% (**表示药物组细胞存活率与模型组细胞存活率相比, P<0.001)。结果表明, 极地雪藻提取物可以有效地帮助NIH-3T3细胞抵抗氧化压力,保护细胞免受氧化应激导致的损伤。

图2 极地雪藻提取物氧化修复实验

2.3极地雪藻提取物修复UVB诱导的光损伤

利用40 W的UVB灯照射背部脱毛的昆明鼠皮肤进行造模，UVB的辐照会诱导皮肤表皮异常增厚, 一般在药物处理后能有效降低异常增厚的现象。在接受UVB照射的28天之后,模型组的表皮厚度明显增加(图3) ,对比空白组,可以发现棘细胞层和角质层变厚,说明UVB照射会诱导表皮变厚以及角质的增加,皮肤屏障容易受损。光损伤后的皮肤通过不同浓度的提取物处理后,通过H&E切片染色可以观察到表皮层细胞增殖变厚程度和角质化程度明显下降,对UVB造成的损伤表现出良好的抵御效果。此外,通过Masson染色分析(图4)，空白组胶原纤维为天蓝色,胶原纤维排列较为紧密规则,模型组胶原纤维为浅蓝色，胶原纤维出现卷曲松散。质量浓度为2, 10和50 g/L极地雪菜提取物给药后，胶原纤维颜色恢复为天蓝色,排列更为紧致,胶原量增加。表明极地雪藻提取物对UVB损伤造成的胶原蛋白损失

有较好的修复作用。

图3 UVB动物皮肤结构HE图片(x 200)

图4 UVB动物皮肤胶原纤维分布图

2.4极地雪藻提取物降低UVB诱导的炎症反应

UVB对皮肤照射造成的氧化损伤不仅仅直接破坏皮肤正常结构,导致角质增生,还会诱导一系列的炎症反应, 导致皮肤红肿瘙痒等症状。通过对UVB造模的小鼠背部皮肤进行IHC染色(图5A) ,并进行光密度分析(图5B)研究炎症因子的表达量及表达位置,研究极地雪藻提取物对UVB诱导的炎症反应的调节作用。在UVB诱导下, 表皮层细胞的炎症因子IL-1、IL-6和TNF-a较空白组均明显增加(***表格炎症因子空白组光密度值与损伤组光密度值相比, P<0.001) ,并主要分布于受UVB诱导厚的表皮层。经过不同给药量的极地雪藻提取物处理,皮肤表皮层的炎症因子有不同程度的下降,较模型组表现出明显的差异(***表示各炎症因子不同质量浓度的药物组光密度值与损伤组光密度值相比, P <0.001) ,说明极地雪藻提取物具有良好的对抗UVB诱导的炎症因子产生,可调节被外界刺激引起的炎症反应。

图5 UVB动物皮肤兔疫组化图(x200) (A)密度分析(B)

UVB的照射可以促进活性氧增加，激活细胞的MAPK通路,转导细胞内AP-1与NF-KB基因的表达,抑制TGFβ通路,前胶原合成减少,基质金属蛋白酶家族(MMPs)生成增加,促使细胞外基质降解,胶原纤维断裂,胶原含量降低,同时引起皮肤炎症反应, IL-1、IL-6、 TNF-a等炎症因子表达量上调。其修复的过程可能是通过清除氧化自由基和生成的活性氧降低MAPK信号通路的激活和传导,下调NF-KB的表达,使得UVB诱导的表皮细胞增殖下降;通过抑制MMPs的生成,细胞外基质的降解和胶原纤维的断裂得以缓解和修复避免胶原的损失。极地雪藻提取物可对IL-1、IL-6和TNF- a的分泌产生调节作用,具有良好的抗UVB损伤修复的效果。

1)在过氧化氢损伤模型下对细胞给予不同质量浓度的极地雪藻提取物,通过MTT法研究细胞活力的变化,实验结果表明,极地雪藻提取物可以保护氧化压力下的成纤维细胞活力不被过氧化氢抑制;

2)在UVB动物造模实验中发现,极地雪藻提取物能有效修复UVB辐射导致的表皮增厚,提高胶原含量,抑制IL-1、IL-6和TNF- a的表达,表现出优良的UVB皮肤损伤修复作用;

3)极地雪藻提取物能减轻细胞的氧化压力,抑制UVB辐射后产生的炎症因子的表达,修复UVB造成的皮肤氧化损伤,可用于开发晒后修复产品与皮肤抗衰护肤品。