提取干燥的雨生红球藻藻粉之后，将胶原蛋白溶液(10 mg/mL, 100 mL)置于37℃水浴环境预热，将胶原蛋白溶液进行柱上固定化胰蛋白酶循环酶切,使用凝胶过滤色谱法对酶解过程进行监测分析。胶原蛋白经柱上酶切后，收集的酶解液用0.45μm滤膜进行超滤。第1步,采用截留分子量为20kDa的膜包进行超滤收集透过液;第2步,采用截留分子量为10kDa的膜包对所收集的透过液进行二次超滤,收集截留液,冻干保存,用凝胶过滤色谱法对截留液进行分子量分析。

将制备得到的虾青素和胶原蛋白多肽分别用乙醇和水溶解,调节pH至5.0,于旋涡混合器上滴加混合，采用硫酸铵沉淀法,收集蛋白沉淀,采用透析法去除硫酸铵,随后将截留液冷冻,采用冷冻干燥机冻干后，低温避光保存备用。

将胶原蛋白溶液(10 mg/mL, 100 mL)置于37°C水浴环境预热,将胶原蛋白溶液进行柱上固定化胰蛋白酶循环酶切,使用凝胶过滤色谱法对酶解过程进行监测分析。胶原蛋白经柱. 上酶切后，收集的酶解液用0.45μm滤膜进行超滤。第1步,采用截留分子为20kDa的膜包进行超滤,收集透过液;第2步,采用截留分子量为10kDa的膜包对所收集的透过液进行二次超滤,收集截留液,冻干保存,用凝胶过滤色谱法对截留液进行分子分析。

虾青素胶原蛋白耦合物分析

虾青素单体制备-般分为3步,即粗提取、皂化和纯化。粗提物经碱皂化后,虾青素单体含量和纯度会得到提高,但皂化时提取出来的虾青素易被氧化,因此在需要虾青素单体时再对粗提物进行皂化,最后需要对皂化液进行纯化。在虾青素的最佳提取条件下,制备出的虾青素含为11.936mg/g,即1g藻粉中可提取11.936mg虾青素单体。通过硅胶层析将制备出的虾青素进行纯度分析,如图1A、B所示,以虾青素标准品作为参照根据峰面积比较,硅胶纯化的虾青素纯度> 90%,将此方法制备的虾青素用于后续的药效实验。采用固定化胰蛋白酶法对胶原蛋白进行柱上循环酶切,经过3次柱上循环酶切后目标肽收率达到最佳,目标肽收率较原料中的含量提高了70%。采用二次分级超滤法对酶解液进行进一步分离分级, 最终得到胶原蛋白多肽终产物的数均分子为15.6kDa,具有良好的分子正态分布形态(M1o=8.3kDa;Mgo=21.0kDa,见图1C) ,目标胶原蛋白多肽总得率为23%,相对收率为174%。

图1 用于耦合的虾青素和胶原蛋白多肽原料色谱图

A:虾青素标准品;B:纯化后的虾青素;C:胶原蛋白多肽。

胶原蛋白多肽和虾青素的特征吸收波长分别在214和480nm左右,胶原蛋白多肽在480nm处无吸收。如虾青素与胶原蛋白多肽反应形成耦合物,则耦合物分子在214和480nm处将同时表现出胶原蛋白和虾青素特有的特征吸收。虾青素为小分子化合物,胶原蛋白与耦合物的分子差异较小,通过以分子大小为分离基准的凝胶色谱分析时,耦合物将具有与胶原蛋白原料接近的色谱保留行为,保留时间接近。见图2,耦合物表现出了与胶原蛋白原料接近的色谱保留特征和与虾青素类似的可检测特征吸收。虾青素与胶原蛋白多肽可反应形成稳定耦合物。且相比于脂溶性的虾青素本研究中所制备的虾青素胶原蛋白耦合物为水溶性成分,可有效改善虾青素的应用局限。

图2 胶原蛋白耦合虾青后的凝胶过滤色谱图(480nm)

虾青素胶原蛋白多肽耦合物改善皮肤光老化损伤作用

01 小鼠皮肤一般形态观察结果

如图3所示，正常对照组小鼠的皮肤红润细滑、有弹性,模型对照组小鼠皮肤粗糙、皮肤变厚,并伴有轻微损伤,出现典型的皮肤光老化特征。虾青素组和耦合物组的小鼠皮肤有轻微光老化损伤特征,但与模型组相比,虾青素组和耦合物组的小鼠皮肤更红润有光泽,皮肤状况得到明显改善,胶原蛋白多肽组和维生素E组的小鼠皮肤老化程度也有所改善,但作用效果没有虾青素组和耦合物组明显。结果表明,虾青素、胶原蛋白多肽、耦合物和维生素E对UV照射引起的光老化具有改善作用,耦合物的改善效果比胶原蛋白多肽明显。通过皮肤涂抹直观判断,水溶性耦合物对皮肤的着色性显著低于脂溶性虾青素。

图3 小鼠皮肤外观形态变化

02 皮肤厚度测定结果

见图4,相比于正常对照组,模型对照组小鼠的皮肤厚度显著增加(P <0.001) ,这表明过多UV照射会使皮肤厚度增加。与模型对照组相比,基质对照组无显著性差异(P>0.05) ,表明基质不会降低光老化弓|起的皮肤厚度增加,基质对其他给药组无干扰作用;虾青素组(P<0.01)、胶原蛋白多肽组(P<0.05)、耦合物组(P <0.001)和维生素E组(P <0.01)的小鼠皮肤厚度明显降低。结果表明,虾青素、胶原蛋白多肽、耦合物和维生素E对UV照射弓|起的小鼠皮肤厚度增生有改善作用,耦合物比胶原蛋白多肽作用效果更为明显。

图4 小鼠皮肤度变化

03 HE染色结果

如图5所示,正常对照组的皮肤结构较完整,表皮层没有过度增生。与正常对照组相比，模型对照组和基质对照组小鼠皮肤角质层和表皮层明显增厚,使整个皮肤的厚度增加。与正常对照组相比，各给药组小鼠的角质层和表皮层厚度明显增厚,但与模型对照组和基质对照组相比,各给药组小鼠皮肤的损伤程度得到缓解,各给药组小鼠的角质层和表皮层厚度均有所下降。结果表明,虾青素、胶原蛋白多肽、耦合物和维生素可改善UV照射弓|起的皮肤光老化损伤,耦合物比胶原蛋白多肽改善作用更明显。

图5 皮肤组织病理切片HE染色

本研究建立了从雨生红球藻中大规模分离提取天然虾青素的最佳工艺,提取率为11.936mg/g,纯度大于90%。实现了均一分子量胶原蛋白多肽以及虾青素胶原蛋白耦合物的制备,耦合物具有虾青素的480nm特征吸收和良好的水溶性,可溶性耦合物对皮肤的着色性显著低于脂溶性虾青素。建立动物光老化模型,研究了虾青素-胶原蛋白多肽耦合物对小鼠皮肤光老化的改善作用。对实验后小鼠进行皮肤形态观察、皮肤厚度测定和HE染色结果分析,结果表明,经过UV照射6周后,与模型对照组相比,经虾青素-胶原蛋白多肽耦合物处理的小鼠皮肤损伤情况可得到改善,这表明虾青素胶原蛋白耦合物仍然保留了虾青素的抗皮肤光老化的生物活性。

目前,预防和治疗光老化已成为医药、化妆品和生物材料领域研究的热点开发安全、有效防治光老化产品是目前相关产业研究的一个重要方向。本研究的虾青素-胶原蛋白耦合物的制备工艺水平简单有效,且在小鼠光老化模型中得到初步的有效验证,本研究有望为医药、化妆品行业开发改善支肤光老化产品提供新思路,促进虾青素和胶原蛋白行业的进一步发展。