雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)为绿藻门、团藻目、红球藻科、红球藻属单细胞淡水绿藻，是虾青素含量最高的水产品其含量可达2% ~ 5%,雨生红球藻虾青素的分子结构中含有多个共轭双键使其具有很强的抗氧化能力,其抗氧化作用及其机制研究是近10年研究焦点领域之一。雨生红球藻还具有延缓衰老抗炎、预防心血管疾病61等作用，可通过抑制脂质过氧化和DNA损伤保护神经系统,通过影响肿瘤细胞生成、生长、凋亡等过程起到抗肿瘤作用。此外,雨生红球藻还具有增强机体免疫功能、抗幽门螺杆菌、预防白内障等作用。
雨生红球藻已被广泛用于食品、化妆品和饲料行业,食用雨生红球藻粉是选育优良雨生红球藻藻种人工养殖采收孢子，再经破壁、干燥等工艺制成。破壁处理可以破坏藻细胞较厚的细胞壁，便于虾青素提取和利用。干燥能降低水分含量便于藻粉的贴藏和运输。由于雨生红球藻中的虾青素在生产、加工和储存过程稳定性差,极易被氧化,通过加入适量的抗氧化剂,可制成油液、乳液、脂质体、微囊化和纳米颗粒等来提高虾青素在食品中的稳定性和生物利用度,但是,由于这些过程中配料带入和工艺改变有可能带来新的食品安全问题。
前期研究表明，在37°C/75%湿度条件下放置3个月，未添加维生素E的雨生红球藻的虾青素下降10.2%,添加维生素E的雨生红球藻仅下降24%,说明雨生红球藻添加维生素E可以增加产c品中虾青素的稳定性。但尚未见二者合用对其安全性和免疫功能影响的文献报道，进一步对其进行研究很有必要。前期急性经口毒性试验结果显示，HPE对小鼠的急性经口毒性最大耐受剂量(maximum tolerated dose,MTD)大于20 g/(kg-bw).属无毒级3项遗传毒性试验(沙门氏菌回复突变试验、小鼠骨髓细胞微核试验、小鼠精子畸形试验)结果均为阴性。本研究采用大鼠30 d喂养试验对HPE的亚急性毒性进行研究,采用小鼠30 d喂养试验对HPE的增强免疫功能进行探究以期为HPE产品的开发和应用提供一定的科学依据。
利用大鼠亚急性毒性试验和小鼠免疫功能试验相结合
◆大鼠亚急性毒性试验
选取体重60 ~ 80 g的SD大鼠80只，随机分为4组，每组20只(雌、雄各10只)。根据该HPE的人体推荐用量3个试验组剂量设为1670、835、418 mg/(kg bw)，分别相当于人体推荐剂量的100、50、25倍。分别称取66.8、33.4、16.7 g HPE,各加食用油至200mL,混匀，配制成334.0、167.0、83.5 mg/m L质量浓度的混悬液，按0.5 m L/100 (g bw)给相应剂量组SD大鼠灌胃;对照组灌胃等体积的食用油。4组大鼠每天一次连续灌胃30 d。
◆小鼠免疫功能试验
根据成人口服推荐用量，设高、中、低3个剂量组，分别为HPE 334、167、84 mg/(kg :bw),分别相当于人体推荐用量的20、10、5倍，并设置阴性对照组每组10只动物。分别称取HPE内容物3.34、1.67、0.84 g,各加食用油至200mL分别配制成16.70、8.35、4.20mg/m L质量浓度的混悬液分别给予相应剂量组动物灌胃,灌胃体积为0.2 m L/10 (g bw)，对照组灌胃等量食用油每天1次连续30 d。
应用SPSS 16.0统计软件进行单因素方差分析。先对数据进行方差齐性检验，方差齐时采用单因素方差分析进行总体比较,有差异再用Dunnett检验进行多个剂组与对照组间的比较。若方差不齐则对数据进行变量转换满足方差齐性检验后用转换后的数据进行统计。
根据大鼠亚急性毒性试验结果显示，在30 d喂养试验期间,4组动物生长发育正常均无死亡，也未见动物有异常行为和中毒表现。可初步判断HPE具有一定的安全性。通过HPE对大鼠体重及食物利用率的影响、HPE对大血常规指标影响、HPE对大鼠血液生化指标的影响、HPE对大鼠脏器重量的影响等指标以及小鼠免疫功能试验中，HPE对小鼠胸腺指数、脾指数的影响、HPE对小鼠细胞免疫的影响、HPE对小鼠体液免疫的影响、HPE对小鼠单核-巨噬细胞吞噬功能的影响的结果指数如下：
表1 HPE对大鼠体重及总食物利用率的影响(n=10)
表2 大鼠血常规指标结果(n=10)
表3 大鼠血液生化指标结果(n=10)
表4 大鼠脏器重量结果(n=10)
表5 HPE对小鼠胸腺指数、脾指数的影响(n=10)
表6 HPE对ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化试验影响(n=10)
表7 HPE对小鼠DTH影响(n=10)
本研究探究了HPE的亚急性毒性和免疫调节作用。大鼠30 d喂养试验结果中，动物的一般情况、食物利用率、血液指标及病理组织学检查均未见异常得出HPE安全性较高的结论。对小鼠30d喂养进行细胞免疫和体液免疫功能试验结果证明HPE具有增强机体的免疫功能。
雨生红球藻是自然界中虾青素含量最丰富的生物，通过微生物含量、重金属含量和初步毒性试验，可以初步判定雨生红球藻的安全性。对其加入维生素E作为稳定剂后进一步作亚急性毒性试验，可进一步为其提供食用安全数据。
研究表明，雨生红球藻能增强机体免疫力，因此本研究未设置单独雨生红球藻组重点考虑不同剂量HPE的效果。对3个不同剂量HPE的免疫功能进行了评价研究表明，与对照组相比，中、高剂量组显著促进小鼠的脾淋巴细胞增殖转化能力，提高小鼠的血清溶血素水平;高剂量组显著提升了DTH能力和小鼠碳廓清吞噬指数,明显增强抗体生成细胞能力;对胸腺和脾指数、NK细胞活性等免疫指标无显著影响，根据保健食品功能评价技术规范，可认定HPE对小鼠的免疫功能有显著的提高作用。
维生素E可以调节体液免疫和细胞免疫细胞的增殖与分化通过影响免疫细胞的活性氧水平、影响细胞因子和趋化因子起到调节免疫功能的作用。雨生红球藻具有增强免疫力和抗肿瘤作用，其作用机制可能与虾青素的抗氧化活性密切相关。虾青素可以降低衰老小鼠脑组织中丙二醛的含量，升高谷胱甘肽的含量提高超氧化物歧化酶的活性，能够高效淬灭单线态氧，通过直接清除氧自由基达到稳定免疫细胞膜结构的目的，保护免疫系统的完整性和功能性。维生素E因具有良好的抗氧化活性，能防止功效成分虾青素氧化增加产品稳定性。因此，雨生红球藻和维生素E两种常用抗氧化剂联合复配，产品稳定性和食用安全性较高并具有增强免疫力功能值得推广应用。
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