溃疡性结肠炎( Ulcerative colitis, UC )是一种慢性、易反复发作的炎症性肠病,其发病机制尚未完全确定。溃疡性结肠炎的主要临床表现为腹痛、腹泻、黏液血便和体重下降。研究表明,肠道通透性增加、免疫屏障受损和肠道微生物菌群失衡是UC发病的重要因中，阻断炎症反应和调节免疫功能是UC临床治疗的常用方法,如使用抗生素、5-氨基水杨酸 盐和免疫抑制剂等进行药物治疗。目前治疗UC的临床方法虽取得成功,但仍存在明显的副作用和局限性,如长期用药会增加患者的经济负担,引起呼吸系统和消化系统的并发症,因此亟需开发新型、有效的结肠炎治疗策略。研究发现天然产品对肠道炎症具有有效、安全性的生物活性,利用天然产品作为替代治疗手段,为减少UC治疗所带来的副作用提供了一个新的选择。

虾青素( Astaxanthin, AST )是一种有效的天然抗氧化剂,主要以游离态和酯化态形式存在。AST具有清除自由基,减轻氧化应激的作用,而氧化应激被认为是加速炎症性肠病恶化的因素之一。越来越多的研究表明,游离的AST通过调节促分裂素原活化蛋白激酶信号通路,抑制NF-KB和激活蛋白-1的活化,从而具有改善UC的作用。因AST和脂肪酸同时存在,故AST酯也备受关注。先前的研究表明,酯化形式的AST相较于游离的AST具有更为显著的清除自由基的能力。二十碳五烯酸( Eicosapentaenoic acid , EPA)是一种w-3长链脂肪酸,已旷泛应用于预防和治疗UC。在UC动物模型中,补充EPA后的结果示, EPA可以改善肠道炎症,且不会引起免疫抑制或其它副作用。EPA改善UC作用机制主要包括抑制细胞凋亡,减少促炎因子的释放,维持肠道完整性和恢复抗氧化能力。学者Prossomariti发现,每天补充2 g EPA (连续90 d )可以缓解UC患者的症状。EPA作为鱼油而闻名,主要以甘油三酯和磷脂的形式存在于海洋食品中。最近,二十碳五烯酸酰化虾青素( Eicosapentaenoic-acid-acylated astaxanthin , EPA-AST )因在调节认知障碍和脂质代谢方面的显著功能而备受关注。作为一种新型功能性脂质, EPA-AST被认为具有AST和EPA的协同优势。然而,对EPA-AST对肠炎影响的研究非常有限。本研究建立3%葡聚糖硫酸钠( Dextran sulfate sodium , DSS )导的结肠炎模型,旨在比较AST和EPA-AST对UC的影响以及其潜在作用机制。

试剂和设备

AST ,通派(上海)生物科技有限公司;葡聚糖硫酸钠( 36000~ 50000u) , MP Biomedical公司;超氧化物歧化酶( Superoxide dismutase , SOD )、髓过氧化物酶( Myeloperoxidase , MPO )试剂盒,南京建成生物工程研究所; Anti-ASC , Cell Signaling Technology ; ZO-1、NLRP3抗体, 艾博抗(上海)贸易有限公司; Occlidin、白细胞介素( Interleukin , IL ) -1B、β-肌动蛋白( β-Actin )的抗体,武汉赛维尔生物科技有限公司;白细胞介素( Interleukin , IL ) -1β酶联免疫试剂盒,深圳达科为生物技术股份有限公司。Multiskan FC酶标仪,赛默飞世尔(.上海)仪器有限公司; RM2016病理切片机，上海徕卡仪器有限公司; DS-U3成像系统，日本尼康光学仪器有限公司; ECLPSE C1正置荧光显微镜，日本尼康光学仪器有限公司; PHS-2F pH计，上海仪电科学仪器股份有限公司。

EPA-AST的制备

在1-乙基- (3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐条件下, EPA和AST在二氯甲烷中于25°C下进行酯化反应10 min ,并由4--二甲氨基吡啶进行催化。有机相中的催化剂依次用1 mol/L盐酸、饱和碳酸氢钠和饱和氯化钠洗涤去除,洗脱后的有机混合物直接装入硅胶柱。然后朋正己烷丙酮溶液( V/V= 9:1 )洗脱色谱柱上的相关分析物( EPA-AST ) , 分离出的EPA-AST蒸发至干(纯度大于90% )。

动物实验

喂养和分组

雄性C57BL/6小鼠( 4~5周龄)体质量15~18 g ,购自青岛大富畜牧有限公司。所有小鼠均饲养在环境控制室,湿度为( 50±15) % ,温度为( 20+2) °C ,光暗周期为12 h。适应性喂养7后,小鼠被随机分为4组(每组8只) :对照组、DSS组、 EPA-AST组和AST组。实验符合动物伦理学相关规定。

建立动物模型

EPA-AST组和AST组小鼠通过口服注射器( 8号灌胃针配1 mL注射器)连续14 d注射150 mg/kg乳剂;对照组和DSS组小鼠进行等量生理盐水灌胃,灌胃针插入小鼠体内的深度为30 mm。根据Meeh-Rubner公式 ,计算小鼠的AST和EPA-AST剂量相当于成人( 70 kg )的剂量( 16.5 mg/(kg:d))。这些剂量是根据先前的研究得出的合理剂量。在最后7 d ,除对照组外,所有小鼠都可以不受限制饮用含有3%DSS溶液的水。实验期间,每天记录小鼠的体质量和粪便。实验结束后,所有动物在禁食-夜后颈椎错位处死。 在解剖过程中,解剖结肠组织并收集粪便样本。所有样本均在超低温下保存。

疾病活动指数( Disease activity index , DAI )评估

疾病活动指数由体质量变化量、粪便性状和血便组成。 每天记录体质量、直肠出血量和粪便稠度。 DAI评估方法见表151。DAI计算公式:DAI= ( 体质量下降评分+大便出血评分+大便性状评分)/3。

表1 疾病活动指数评分标准表 

血清和结肠生化指标测定

血液样本经离心后获得血清( 10000 r/min , 15 min)。将结肠样本和生理盐水按照1:9的比例混合。然后将混合溶液在冰浴条件下匀浆,随后在10000 r/min下离心15 min得到上清液。使佣BCA法测定血清和结肠中的总蛋白浓度,并按照试剂盒说明测定SOD和MPO含量。

苏木精伊红( Hematoxylin-eosin , H&E )染色

通过H&E染色进行结肠组织病理学评价。切除约1 cm长的远端结肠组织标本,将其固定在4%多聚甲醛溶液中,然后用石蜡进行包埋。随后,对结肠切片进行H&E染色。组织损伤评估见表2。

表2 结肠组织病理学评分标准表

TdT介导的dUTP缺口末端标记( TdT-mediated dUTP nick-end labeling , TUNEL)测定

根据生产商提供的检测步骤,使用TUNEL检测试剂盒来检测结肠细胞的凋亡情况。通过分析3个视野计算阳性染色细胞的比例。凋亡率是通过计算凋亡数目与总数目的比率得出。

免疫组织化学( Immunohistochemistry , IHC )染色

将采集的结肠组织进行石蜡包埋,以便后续分析。随后,对石蜡包埋的组织进行去石蜡处理并重新水化。进行抗原检索和阻断后,用特异性靶向一抗ZO- 1和Occlidin对样本进行孵育。用磷酸盐缓冲液对样本进行冲洗后,使用3,3'-二氨基联苯胺四盐酸结合辣根过氧化物酶标记的二-抗对组织进行染色。所有样本均在光学显微镜下检查。

Western blot堍疫印迹分析

用含有蛋白酶抑制剂的RIPA裂解缓冲液将冷冻在-80 °C的小鼠结肠组织匀浆,离心后得到上清液。用BCA检测试剂盒测定蛋白质浓度,并用变性蛋白质上样缓冲液在沸水中孵育10 min。20 μg变性蛋白经十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis , SDS- PAGE)分离,然后转移到PVDF膜上。PVDF膜使用5%牛血清白蛋白封闭2h,与抗β-actin ( 1:1000 )、NLRP3 ( 1:1000 )和ASC ( 1:1000 )在4℃孵育过夜,然后与辣根过氧化物酶标记的二抗在室温下孵育2h。蛋白质的表达可借助一体式化学发光成像仪来呈现,并使用Image J软件对蛋白质进行定分析。

酶联免疫吸附试验

结肠组织与磷酸盐缓冲液按1:9的比例匀浆后,在4000 r/min条件下离心10 min。随后,收集上清液用于进一步分析。 按照制造商提供的说明,使用酶联免疫试剂盒对结肠中炎症因子IL-1β的水平进行量化。

粪便微生物群的16S rDNA测序

从粪便样本中提取基因组DNA。解冻后,使用200 mg经预处理的粪便样本进行DNA提取。使用Qubit 3.0 DNA检测试剂盒对基因组DNA进行精确定量。使用llumina桥式PCR扩 增16S rDNA的V3-V4区域19。

统计分析

数据以“平均值+标准差( SD)”表示。使用SPSS 22.0版进行数据处理,对照组和DSS组平均值之间的差异采用t检验。采用单因素方差分析( ANOVA )和Tukey's事后检验来比较治疗组和DSS组。使用Image J软件( 201 4版)进行IHC分析。

AST和EPA-AST减轻DSS诱导的结肠炎症状

如图1所示,与对照组相比, DSS组的疾病活动指数明显升高( P0.01 )。AST和EPA-AST可抑制( P<0.05 ) DSS引起的DAI上升(图1a)。与对照组相比, DSS治疗明显降低了小鼠的体质量( P<0.05)。给予AST和EPA-AST可防止DSS引起的体质量下降( P<0.05)。经过DSS治疗后, DSS组小鼠的结肠长度明显减少( P<0.05 ) ,而AST组和EPA-AST组的结肠长度都有所改善( P<0.05)。 因此,在减少体质量下降,降低DAI和增加结肠长度方面, EPA-AST比AST更有效。

图1 EPA-AST和AST改善DSS诱导的结肠炎的症状

Fig.1 EPA-AST and AST improved symptoms of DSS-induced colitis

注: Control组表示生理盐水组, DSS组表示模型组, AST组表示虾青素组, EPA-AST表示二十碳五烯酸酰化虾青素组。*.P<0.05, **.P<0.01 ,同母表示组间差异显著( P<0.05)。

AST和EPA-AST对调节氧化应激的影响

如图2所示,检测血清和结肠中的超氧化物歧化酶( SOD )活性。与对照组相比, DSS组的SOD活性显著下降(P<0.05)。然而，AST组、EPA-AST组和DSS组的血清和结肠中的SOD活性没有统计学差异。注: *.P<0.05 , **.P<0.01 ,相同字母表示组间无差异显著。

AST和EPA-AST改善DSS诱导的结肠炎的组织学病变

通过H&E染色和TUNEL染色评估结肠的组织学和形态学特征(图3a )。H&E染色显示, DSS组的腺体结构异常。黏膜层黏膜下层肌层和结肠壁均出现广泛损伤,隐窝深度和数量减少。服用AST和EPA-AST能明显改善组织学病变( P<0.05) , EPA-AST对DSS引起的结肠炎比AST更有效(图3b , P<0.05)。TUNEL染色显示DSS治疗后凋亡( TUNEL阳性)细胞数量增加。与模型组相比, AST组和EPA-AST组的病情缓解程度不同。同时,在降低细胞凋亡指数方面, EPA-AST比AST有更明显的效果(图3c)。

图3 AST和EPA-AST对DSS诱导的结肠炎的组织学病变研究

AST和EPA- AST对肠道渗透性的影响

研究发现, Occludin和ZO-1证实了结肠组织屏障蛋白的表达(图4)。经DSS处理后, Occludin和ZO-1的表达量减少( P<0.05)。AST和EPA-AST治疗能够有效减少损失( P<0.05)。值得注意的是,与AST相比, EPA-AST能更显著地增加Occludin和ZO-1的表达(P<0.05 )。

图4 AST和EPA-AST对肠道屏障完整性的影响

EPA-AST减少炎症细胞因子的表达

Western blot印迹结果显示,与对照组相比, DSS组NLRP3 ( P<0.01)、ASC (P<0.01 )蛋白表达上调(图5 )。只有EPA-AST能明显抑制NLRP3的表达( P<0.05)。而AST和DSS之间没有明显差异(图5b)。EPA-AST在降低ASC (图5b )表达方面的保护作用优于AST。

与对照组相比, DSS诱导的小鼠结肠中的促炎细胞因子IL-1β明显增加( P<0.001 )。值得注意的是, AST和EPA-AST都能抑制L -1β的表达( P<0.05 )。MPO活性已被广泛用于反映肠道炎症。在本研究中, DSS组的MPO活性几乎是对照组的2倍(图5d , P<0.05)。与DSS组相比, AST和EPA-AST能够抑制MPO活性( P<0.05 )。此外,两组之间没有观察到明显差异。

图5 AST和EPA-AST对NLRP3炎症小体的影响

AST和EPA-AST改善肠道微生物群的失衡状况

多样性用于评估肠道微生物菌群的丰富度和组成。AST和EPA-AST的干预明显抑制了DSS处理引|起的Shannon和Simpson指数的下降。于Chao 1、ACE指数,在AST和EPA-AST组中呈上升趋势(表3 )。图6a和6e描述了主要肠道微生物组在]水平的平均相对丰度,发现5个主要的门,即拟杆菌门( Bacteroidota)、厚壁菌门( Firmicutes)、彰菌门( Proteobacteria)、疣微菌门( Verrucomicrobia )和放线菌门( Actinobacteria ) , 约占总数的98%。AST和EPA-AST增加了DSS诱导的拟杆菌和疣微菌的相对丰度。与DSS组相比, AST和EPA-AST降低了厚壁菌门和变形菌门的相对丰度。

在纲水平上(图6b和6f) , 与DSS组相比, AST和EPA-AST增加了拟杆菌纲( Bacteroidia )和放线菌纲( Actinobacteria )的相对丰度,降低了γ-变形菌纲( Gammaproteobacteria)、丹毒丝菌纲( Erysipelotrichia )和芽孢杆菌纲( Bacilli )的相对丰度。在目水平上(图6c和6g) , AST和EPA-AST增加了拟杆菌目( Bacteroidales )的相对丰度,降低了肠杆菌目( Enterobacterales)、丹毒丝菌目( Erysipelotrichales )、弯曲菌目( Campylobacteraceae )的相对丰度( P<0.05 )。在科水平上, AST和EPA-AST增加了拟杆菌科( Bacteroidia )、丹毒丝菌科 ( Erysipelotrichaceae )和疣微菌科( Verrucomicrobiaceae )的相对丰度,降低了芽孢杆菌科( Bacili)的相对丰度(图6d、6h)。

图6 肠道微生物菌群的相对丰度

结肠炎是一种病因复杂的多因素疾病,以肠道黏膜炎症为主要特征。目前结肠炎的常见疗法仍存在许多问题,如副作用和缺乏持久疗效。因此,寻找一种有效的功能食品,针对已知的损伤机理进行治疗,对于治疗结肠炎非常重要。本研究阐述了EPA-AST对抑制DSS诱导的小鼠结肠炎的作用。

为进一步了解EPA-AST对DSS引起的C57B/L6小鼠肠道损伤的保护作用,研究其对紧密连接蛋白调控的影响。研究发现,肠道屏障的完整性是维持肠道健康和防止有害物质进入肠道组织极其重要的一点。肠道炎症和上皮细胞凋亡的增加可能会损害肠道屏障完整性,从而导致肠道功能障碍。肠道通透性的调节与紧密连接蛋白有关,包括ZO-1、Occludin和Claudin-1。之前的研究发现,磷虾油(富含Omega-3多不饱和脂肪酸和AST )可保护结肠组织的完整性,并恢复紧密连接蛋白ZO- 1和Occludin的表达,从而缓解结肠炎。本研究结果证实,在DSS诱导的急性结肠炎中,服用EPA-AST在恢复ZO- 1和Occludin的表达方面优于AST。因此,紧密连接蛋白基因的表达可能是EPA-AST抗结肠炎的原因。

在DSS诱导的结肠炎模型中, SOD酶活性降低,这表明体内ROS水平升高,脂质过氧化对细胞和组织造成损伤。如图2所示,本研究中DSS组小鼠的SOD活性明显低于对照组,表明DSS组小鼠体内发生了氧化应激。虽然AST组和EPA-AST组的SOD活性有所增加，但AST、EPA-AST和模型组之间没有统计学差异。结果表明, EPA-AST对UC的改善可能并不依赖于氧化应激。

促炎反应是结肠炎的一个特征。结肠上皮屏障的破坏和上皮细胞凋亡的增加诱导了炎症因子的积累。据报道,促炎细胞因子的释放与UC的发病机制有关。NLRP3是最具代表性的炎症性小体,可以识别多种危险信号。NLRP3具 有诱导分泌促炎细胞因子IL-1B的潜在能力，与炎症性肠病密切相关。在UC模型中, NLRP3的激活增强了炎症反应。然而,抑制NLRP3的活化可缓解炎症反应并改善UC症状。因此, NLRP3炎症小体被认为是治疗结肠炎的一
个很有前景的靶点。Yan发现, w-3脂肪酸可通过抑制NLRP3的活化来抑制IL-1β的释放。本研究结果表明, EPA-AST和AST有可能通过调节NLRP3炎症小体改善肠道炎症, EPA-AST的抗UC作用可能部分依赖于抑制NLRP3的活化。

特定的肠道微生物群与多种疾病的病理进展有关,包括代谢性疾病和胃肠道癌症。近年来,关于肠道微生物在UC发病机制中的作用的研究越来越广泛。研究指出, 在UC的动物模型和临床试验中均观察到肠道菌群的多样性降低和菌群结构失衡。

本研究中, DSS的干预降低了肠道菌群的多样性。补充EPA和EPA-AST后, Shannon和Simpson增加,表明EPA和EPA-AST在本研究中对肠道菌群多样性的分布具有潜在的影响作用。肠道中有益菌和有害菌的平衡对维持肠道健康至关重要。研究表明, UC患者的肠道有益菌(如拟杆菌门和疣微菌门)水平降低是肠道微生物菌群失衡的标志。拟杆菌和疣微菌门与免疫系统相互作用,可以维持免疫系统与肠道微生物菌群之间的平衡,防止有害病原体增殖。此外,拟杆菌门和疣微菌门丰度降低会导致肠道微生物菌群失调和炎症加剧，从而加重UC症状。经AST和EPA-AST干预后,拟杆菌门和疣微菌门的数量呈上升趋势。UC患者肠道微生物菌群中的厚壁菌门和变形菌门]过度生长或失衡会破坏肠道环境,产生有害代谢产物并引发炎症反应,从而导致UC的发展和恶化。经过AST和EPA-AST干预后,厚壁菌门和变形菌门的丰度下降,这表明补充AST和EPA-AST可以通过增加潜在有益菌(如拟杆菌门和疣微菌门)的丰度和减少潜在有害菌(如厚壁菌门和变形菌门)的丰度来重塑结肠炎小鼠的肠道微生物菌群。

EPA-AST在减轻DSS诱导的结肠炎典型症状方面的改善效果优于AST。EPA-AST可改善肠道屏障,调节肠道炎症, 抑制结肠上皮细胞凋亡。此外, EPA-AST能够增加a-多样性,并通过增加益生菌种类的丰度和降低致病菌的丰度来调节肠道菌群失调。本研究结果表明，EPA-AST可能是一种有前景的辅助治疗结肠炎的营养食品。