本论文以秀丽隐杆线虫为模型研究发现螺旋藻蛋白提取的作用，从利用食物清除率实验、自然条件下的寿命实验、运动能力检测、脂褐素检测、繁殖能力检测、DPPH清除实验、氧化胁迫条件下的寿命实验、活性氧实验等方式进行。

螺旋藻蛋白提取物对线虫摄食的影响

图1 SPPE对线虫饮食的影响

为了检测不同浓度SPPE对线虫生长的影响,通过检测96孔板中的OD57o来显示大肠杆菌的浓度从而反映线虫摄食速度。选取0.5、1、2、4、8 mg/m等5个浓度的SPPE饲喂线虫,观察SPPE浓度对线虫饮食的影响。

由于样品有颜色对吸光度有一定的干扰, 为了减小误差,将每次检测的OD570值除以第-次检测的OD57o值,比值作为纵坐标进行作图。样品组与对照组相比,随着SPPE浓度升高,线虫的饮食发生变化，浓度低于2 mg/m L时, SPPE对线虫的饮食没有明显影响;当浓度高于2 mg/m L时, SPPE对线虫的饮食有轻微的抑制;浓度为8 mg/m L时,对线虫饮食抑制较明显。

自然条件下SPPE对线虫寿命的影响

图2 SPPE对自然条件下线虫寿命的影响

于秀丽线虫生命周期较短,被广泛用于衰老领域研究,最直接的方法就是检测线虫在自然条件下寿命的变化,通过食物清除率实验最终选取0.5、1、 2 mg/m L 3个浓度进行后续实验。通过比较对照组与饲喂3个浓度SPPE的线虫在自然条件下的存活情况,来研究SPPE对线虫的衰老是否有延缓作用。与对照组相比,饲喂SPPE后的线虫在自然条件下的存活时间得到延长,生存曲线向右平移图2) ,由表1可知0.5 mg/m L的SPPE对线虫的平均寿命提高了7.15%。

表1 SPPE对自然条件下线虫寿命的影响

SPPE对线虫的运动能力的影响

图3 SPPE对秀丽线虫运动能力的影响

随着线虫的衰老,运动能力逐渐减弱，通过检测线虫头部摆动频率来展示线虫的活动，比较饲喂SPPE的线虫与对照组线虫的摆频,评价线虫的运动能力,从而判断SPPE对线虫衰老及健康程度是否有影响,图3可知饲喂SPPE后第5天和第10天的线虫头部摆动频率比对照组都有所提高,经计算SPPE能使第5天和第10天的线虫摆频增加20%左右,对线虫的运动能力有改善的作用。

SPPE对线虫脂褐素的影响

脂褐素是伴随着氧化损伤和细胞自噬而产生的物质,随着衰老的进行而聚集在肠道,是衰老的一个重要指标,能表达荧光信号。为了研究螺旋藻蛋白提取物对线虫脂褐素水平的影响,对不同组线虫的脂褐素聚集情况进行分析,用Image J 1.8软件对图片进行处理得到相对荧光密度(RFU) ,随着SPPE的浓度的提高,样品组线虫体内的相对荧光密度减小(图4a) ,经计算2 mg/m L的SPPE可以降低线虫体内26.39%的脂褐素聚集,图4c为饲喂2 mg/m L SPPE的线虫,其肠道内的脂褐素聚集程度明显低于对照组(图4b)。

图4 SPPE对线虫脂褐素聚集的影响

SPPE对线虫繁殖能力的影响

大量研究表明抑制线虫的繁殖能力对线虫的寿命有延长的作用,为了排除SPPE对繁殖能力的影响而产生效果，我们检测了饲喂SPPE前后线虫的后代数量,发现SPPE对线虫后代数量几乎没有影响(图5) , SPPE不是通过抑制线虫的繁殖能力而产生的延衰作用。

图5 SPPE对线虫繁殖能力的影响

SPPE的DPPH清除能力

衰老的氧化自由基学说认为衰老和衰老相关疾病的发生与自由基有很大关系,体内自由基增多会对细胞乃至机体造成损伤,因此有效地清除体内自由基对延缓衰老有很大的帮助[15]。已有文献报道螺旋藻具有抗氧化方面的活性,为了进一步研究SPPE延衰的作用机制,从螺旋藻的抗氧化活性方面展开研究。DPPH自由基清除实验能检测化合物清除自由基和供氢的能力,从而被广泛地应于评价物质的抗氧化能力,图6显示SPPE具有很高的DPPH清除活性,且随着浓度的升高,该提取物的DPPH清除率逐渐增高。SPPE浓度为2mg/m L时DPPH清除率已迅速上升至70%,浓度高于2 mg/m L时清除率上升趋势趋于平缓8 mg/m L浓度时SPPE的DPPH清除率E接近90%。

图6 SPPE的DPPH清除能力

表2 SPPE的DPPH清除能力

氧化胁迫下SPPE对线虫寿命的影响

图7 氧化胁迫下SPPE对秀丽线虫生存能力的影响

百草枯(Paraquat, PQ)具有与多巴胺能神经毒素相似的结构,可诱发氧化应激,被广泛用于模式生物的氧化和神经损伤造模，为了进一步研究SPPE的体内抗氧化活性, 本文以百草枯为氧化剂对野生型秀丽线虫进行氧化应激构建氧化损伤模型,通过检测饲喂SPPE后的线虫在氧化应激条件下的存活情况，来判断SPPE对秀丽线虫的抗氧化保护作用。通过图7可以观察到氧化应激下线虫的生存情况，与对照组相比,饲喂3个浓度的SPPE,均能使线虫生存曲线右移, 2 mg/m L浓度下延长氧化胁迫下线虫俦命的效果最明显,平均寿命比对照组延长约15% (表3)。

表3 氧化胁迫下SPPE对秀丽线虫生存能力的影响

SPPE对秀丽线虫体内ROS水平的影响

图8 SPPE对线虫体内活性氧(ROS)水平的影响

衰老的自由基学说认为细胞内活性氧的产生是影响细胞乃至机体寿命的主要决定性因素,细胞内的活性氧可以伤害线粒体的成分,氧化生物分子,引发降解过程。所以减少这些有害的活性氧的产生是维持机体健康、延长寿命的一个很好的策略。通过比较样品组与对照组线虫产生ROS的水平,来研究SPPE是否通过降低机体活性氧的产生来发挥抗氧化作用。采用DCFH-DA来检测线虫体内的活性氧水平, DCFH-DA可以被活性氧氧化,产生具有荧光的DCF,用荧光酶标仪检测DCF荧光强度可以反映出活性氧的水平。饲喂低中高3个浓度的SPPE,线虫体内的活性氧水平都有降低并且随着浓度的升高,活性氧的水平越低, 2 mg/m L下活性氧水平最低(图8)。

随着全球老龄化的加重,衰老给社会带来的问题愈加严重,研究延缓衰老、保持人体健康状况成为研究者们的焦点。衰老的机制比较复杂相关的影响因素有很多,其中- -个很重要因素就是氧化损伤,已有大量研究表明螺旋藻及其含有螺旋藻的补充剂具有抗氧化功效, Gutierrez等研究了螺旋藻产品的抗氧化及抗炎作用，也有人研究螺旋藻抗肿瘤活性, Wang研究钝顶螺旋藻蛋白的酶解多肽对5种肿瘤细胞的抑制作用。但目前对螺旋藻蛋白活性的研究主要局限以上几个方向,而对其在延缓衰老方向的研究甚少。本文利用秀丽线虫为模型研究螺旋藻蛋白提取物的延缓衰老作用，并初步探讨其作用机制。研究发现螺旋藻蛋白提取物能提高线虫自然条件下的平均寿命,增强线虫的运动能力,降低衰老线虫肠道中脂褐素的聚集优化线虫的健康状态;由于大量文献报道抑制线虫的生殖能增强线虫的抗性和延衰，本论文排除了螺旋藻蛋白提取物可能是由于对线虫繁殖能力抑制而产生延衰和抗氧化效果,不但如此,螺旋藻蛋白提取物对线虫的生殖能力还有轻微的增强功效,增加了野生型秀丽线虫的后代数量。为了进一步探讨其作用机制,对SPPE的抗氧化作用进行体外和体内实验研究,结果示螺旋藻蛋白提取物具有很强的体外自由基清除活性;在线虫胁迫实验中,螺旋藻蛋白提取物也能显著提高线虫在百草枯诱导的氧化胁迫下的存活时间,并组能降低线虫体内ROS的水平。

本论文以秀丽隐杆线虫为模型研究发现螺旋藻蛋白提取具有延衰作用,能提高线虫的健康状态而不影响其生殖能力;并且通过体外和体内实验验证了螺旋藻蛋白提取物的抗氧化活性,发现螺旋藻蛋白提取物具有很强的抗氧化活性,与文献报道具有抗氧化效果相符。接下来需要对其延衰作用机制进行深入研究,主要研究螺旋藻蛋白对抗氧化酶和衰老相关基因的调控。衰老另一个重要的表现就是神经损伤,接下来还需要研究螺旋藻在保护神经方面的活性研究;另外在实验中发现螺旋藻对线虫的繁殖能力有一定的增强作用, 后续可对其在生殖方面展开深入研究,为螺旋藻在食品领域新功能的开发利用奠定基础。