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高产虾青素的红法夫酵母菌株选育研究进展
时间:2024-03-07 来源:admin

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虾青素(Astaxanthin) , 又名虾黄素,化学名为3,3-二羟基4.4'-二酮基_B,β"胡萝卜素,分子式C4oHs2O4,分子结构包括β_紫罗兰酮环和C=C共轭烯烃,这种特殊的结构使虾青素具有很强的抗氧化能力。其抗氧化能力是β-胡萝卜素的10倍、叶黄素的200倍、维生素E的550倍。虾青素是目前自然界中已发现的最强的抗氧化物,在2012年被国家食品药品监督管理局以抗氧化的保健功能批准为保健食品目前以抗氧化为主要保健功能的产品共339个。天然虾青素广泛存在于鱼类、甲壳类、藻类中,主要以脂肪酸酯的形式存在。除抗氧化活性外,虾青素还具有多种生理功能,如抗炎、抗凋亡、抗癌、抗糖尿病、预防心血管疾病、保护神经等作用。目前,虾青素主要通过化学合成、动植物提取和微生物发酵生产,化学合成生产的虾青素因其价格具有优势(较天然虾青素),在市场上占据较大份额。由于合成虾青素在生产过程中会存在中间物残留, 导致合成虾青素存在生物活性和利用率低等问题;同时随着消费者对环境和健康问题的日益关注,近年来全球市场对天然虾青素的需求逐年增加。


红法夫酵母属于真菌界、真菌门、半知菌亚门、担子菌纲、隐球酵母科、法夫酵母属唯一种。最初,红法夫酵母由Miller等在日本和太平洋西北地区树木渗出液中分离得到并命名, 后续研究发现红法夫酵母可以合成虾青素。由于红法夫酵母具有生长周期短、繁殖能力强、能利用多种碳源、便于发酵罐培养等特点,是目前工业生产天然虾青素的来源之一,但虾青素的产量是制约红法夫酵母在工业中应用的重要因素。本文从育种、优化培养基及合成途径改造等方面综述了提高红法夫酵母虾青素浐量的主要方法,以期为提高红法夫酵母虾青素产量提供理论依据。


01
产虾青素菌种选育

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野生型红法夫酵母虾青素产星一般为0.2~0.4 mg/g。选育高产虾青素的红法夫酵母菌株是提高虾青素产量的有效方法,主要是利用物理、化学及生物方法使野生菌株发生突变,通过改变菌株生理生化指标来筛选目的菌株。物理方法是诱变育种最常用的方法,可以在较短的时间内快速、大量进行菌株的诱变,缩短育种周期,提高育种效率;同时,物理诱变育种可以产生多种突变体,包括单一基因突变和复杂多基因突变体,从而为育种提供更多的选择性。诱变育种中常用的物理方法有紫外诱变、γ-射线、离子束等。实验室最常用的是紫外诱变。有学者认为,紫外线会使红法夫酵母菌株产性更多的活性氧而对菌体产生损伤,可能会提高菌株虾青素的产量以减轻氧化损伤。通过2轮紫外诱变和光复活的方法诱变选育出3株高产菌株,其中UV2-12菌株虾青素产量最高,产虾青素能力较原始菌株提高了46%。通过使用不同剂量的γ-射线对红法夫酵母进行诱变,出发菌株虾青素产量为1.061 mg/L ,得到的突变菌株中虾青素产量最高可达15.887 mg/L。利用低能离子束注入红法夫酵母的方法,获得菌株E5024,虾青素产量为2.512 mg/g细胞干重( DCW) , 较野生型菌株产量提高了125.5%。虽然物理方法可以提高虾青素产量,但物理育种无法精确控制突变点和突变类型,突变可能会发生在不相关的基因上,突变强度也难以调节,可能会导致突变效果过强或过弱。


常压室温等离子体( Atmospheric and Room Temperature Plasma , ARTP )是近年来发展出的一种新的诱变育种方法,工作原理为在大气压下产生高浓度活性粒子作用于微生物细胞,与DNA、蛋白质等生物大分子作用,造成DNA损伤,诱发细胞的修复机制从而引发突变。ARTP具有操作简单、成本低、诱变效率高、适用范围广等优点,得到了越来越多科研工作者的关注与广泛应用。Zhuang[231采用ARTP和紫外诱变。以二苯胺为筛选剂筛选出突变株Y1 ,其虾青素含量为5.38 mg/g ,比原菌株提高了21.20% ; Jin124]将基因工程酿酒酵母采用ARTP诱变后,菌株虾青素产量由5.5 mg/g提高至10.1 mg/gARTP较传统物理或化学方法效率更高,可以更精准地作用于DNA序列上,使突变更具有可预测性,也可以针对不同类型的菌株进行适应性调整,根据样品的不同调节诱变参数和等离子体处理时间和强度,实现个性化育种。ARTP虽然提高了育种效率,但可能会产生不稳定的遗传变异,有一定的潜在风险,诱变可控性也有限对于特定的基因还是有一定随机性,无法精确控制突变点位和突变类型;同时ARTP对于技术和设备要求较高,企业一般不具备相关设备,无法大规模应用于市场。


在化学诱变方面,常用的诱变剂有亚硝基胍(NTG)、甲基磺酸乙酯( EMS)、硫酸二乙酯等,其中以NTGEMS最为有效。NTG通过烷化作用,使菌体DNA分子碱基和磷酸部分被烷化, DNA复制时会发生错配,导致基因突变。有研究采用酶法制备红法夫酵母原生质体,再通过NTG诱变及β紫罗酮筛选的方法进行菌株选育,该产虾青素菌株用发酵罐放大培养后,其虾青素产量和含量分别可达到500-600 mg/L5 000~6 300 mg/kg DCW,生物量可达80-110g/L。学者在试验中以X. dendrorhous AS2. 1557为出发菌株,使用NTG进行诱变,通过“颜色筛选法”从平板上初步筛选出菌落颜色较深的突变株AS1-3,然后采用超高效液相色谱法检测菌株的虾青素产量,突变株AS1-3单位体积虾青素产量为0.46μg/mL ,单位DCW的虾青素产量为110.53 ug/g ,分别是出发菌株的1.76倍和2 24倍。此外,原生质体融合技术也是近年来广泛应用于选育菌株的-种有效方法[281。原生质体融合可以将2个不同种属、不同亲缘关系的细胞结合起来,获得一些新的组合体,在遗传和表型上产生新的变异性状,通过将2种不同细胞的原生质体诱导融合[常用诱导融合的方式有化学聚乙二醇( Polyethylene Glycol, PEG )融合、电诱导融合和激光诱导融合] ,根据试验目的选择形态、生长等方面与亲代差异较大的融合子,培育并进一步评估融合子在性状和遗传层面的变化。Wang[30]利用原生质体融合技术将三孢布拉氏霉14271 (+ )14272 (-)进行融台,获得了2个番茄红素和β胡萝卜素产量较高的融合体Fu-1Fu-2 , Fu-1的番茄红素产量达到0.6 mg/g生物量干重( DW )0.90 mg/g DW (分别是14271 (+ )14272 (-)3.62倍和5.44) , β-胡萝卜素产达到22.07 mg/g DW (分别是14271(+ )14272 ()1.72倍和2 89) , Fu-2的番茄红素产量和β_胡萝卜素浐量也均达到14271 ( + )14272(-)1-3倍。化学诱变和原生质体诱变能够有针对性地诱发特定基因的突变,从而实现目标基因的改变或功能调整,也具有更高的可控性。然而,相较于物理诱变,以上方法的诱变效率较低,需要处理大量样本才能够获得足够多的突变体,而且可能会引入影响细胞生理功能、代谢能力的次生突变,还可能会对细胞造成永久性损伤,对突变体的遗传稳定性产生一定影响,导致突变后代的品质下降。此外,某些诱变剂具有一定毒性对于试验人员也有一定风险。


02
红法夫酵母培养及发酵条件优化

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虾青素是红法夫酵母的次级代谢产物,除诱变育种外,培养基组分和培养条件的优化也是提高红法夫酵母虾青素浐量的有效手段。红法夫酵母可以利用多种碳源,如葡萄糖、木糖、蔗糖、麦芽糖、淀粉、有机酸、醇类;红法夫酵母对简单的铵盐、硝酸盐、氨基酸、硫酸铵、氮源混合物(如酵母提取物、麦芽提取物、蛋白胨)等氮源均能加以利用[321。研究表明,碳氮比会影响红法夫酵母虾青素的合成,低初始碳氮比有利于红法夫酵母的生长,但对类胡萝卜素的合成有负面影响;高碳氮比有利于虾青素合成,但葡萄糖浓度过高会抑制红法夫酵母生长和虾青素的积累。通过单因素试验和Plackett- Burman设计法选 出对虾青素生物合成较重要的影响因素为葡萄糖和复合氨源(柠檬酸三铵:牛肉膏=2 : 1 ) , 利用响应面法确定葡萄糖和混合氮源的最佳添加量分别为3.65%0.45%。一些微量元素和金属离子也能明显影响红法夫酵母虾青素的生物合成,如磷元素和Mg2+Ca2+、 Fe3+、 Cu2-等。红法夫酵母属于中度嗜冷菌,生长温度范围为4~27°C ,适宜生长温度为18~22℃ ,适宜pH5-6 ,但红法夫酵母适宜的生长温度、pH并不是虾青素积累的最适温度和pH ,在生产过程中,根据不同细胞周期调整温度和pH可以有效提高虾青素产量。研究在红法夫酵母发酵过程中分阶段控制pH ,结果显示虾青素产量和细胞产率均高于对照组。类胡萝卜素的合成是一个需氧过程,氧气含量影响细胞生长、细胞形态、营养吸收和类胡萝卜素的合成。试验表明,不同的初始体积氧传递系数对细胞的生长和类胡萝卜素的积累有显著影响,在初始体积氧传递系数达到1485/h,红法夫酵母在56 h达到最大生物量,其他情况下则需要80 h以上,且虾青素占总类胡萝卜素的比例由46%提高至80.6%,表明较高的供氧量利于β-胡萝卜素向虾青素转换。


研究发现,添加虾青素合成的前体物质也能够有效提高红法夫酵母虾青素的合成和积累。学者在红法夫酵母摇瓶发酵过程中添加橙汁、绿茶汁和番茄汁能明显促进细胞生长及虾青素合成,虾青素产量和含量较对照组提高124%128%。而在培养基中添加5%紫苏提取物,虾青素产量由19 mg/L提高至31.8 mg/L ,并且在添加紫苏培养物的批量发酵罐中的培养时间较对照组缩短了2d。成熟番茄汁中含有大量番茄红素,番茄红素是虾青素合成的前体物质,适当添加番茄红素对合成虾青素有促进作用。在红法夫酵母培养至36 h时添加番茄汁,虾青素含可达1.318 mg/g ,虾青素产量为17.87 mg/L。甲羟戊酸是虾青素合成中另一种重要的前体物质,不仅参与虾青素的合成,也是其他类胡萝卜素的重要前体分子,能够调节虾青素合成的速率和产量。学者在培养基中添加0.1%甲羟戊酸,虾青素产量增加400%左右。


03
当前虾青素研发现状及展望

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天然虾青素具有极强的抗氧化性以及多种生物活性,被广泛应用于食品、化妆品、饲料等领域。总体来说,利用红法夫酵母生产虾青素的研究已经取得些进展,如筛选出较野生型产量大幅提升的菌株和构建了基因工程菌株,但仍面临着一些挑战作为一种天然虾青素的来源红法夫酵母相较于雨生红球藻产量方面仍有待提高,同时需要解决一系列问题包括优化生产工艺和虾青素提取方法、试剂的选择、探索红法夫酵母生产虾青素的降解途径和代谢调控机制、延长虾青素的保存期限、提高抗氧化性能以及开拓红法夫酵母源虾青素市场。[1]


而目前较为主流的虾青素提取方式是从雨生红球藻中进行提取。我国是全球雨生红球藻的主要产区,相关资料显示,仅云南省目前就占有雨生红球藻全球产能的30-40%,得天独厚的资源禀赋不仅孕育了红球藻,也让成长于程海湖畔的云南绿A生物有限公司借力对红球藻进行了一系列研发,并于2010年10月被卫生部批准为新资源食品,开启了我国红球藻产业化的起点。


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部分文献参考:

[1] 孙克诚,胡丹丹,袁文华等.高产虾青素的红法夫酵母菌株选育研究进展[J/OL].中国畜牧杂志:1-10[2024-02-27].


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