研究从钝顶螺旋藻品系ZJU0116由本研究团队选育的藻种中,采用Zarrouk's培养液培养。实验室培养在智能光温自控培养箱中进行,以日光灯为光源，在作不同温度培植试验时, 温度设为定值,光通量和光照时间不变;规模化培植生产试验在浙江省建德市微藻试验基地进行,培植池建于钢架塑料薄膜温室内、长50.7 mx宽7.5 m ,藻液的平均深度30 cm、流速5 m/min。实验室和工厂化培植试验,每组均设3个重复。参考已有的实验方法，对其进行诱变处理及突变体筛选、生物量及蛋白质含量测定、显微镜形态和RAPD分析得出实验结果如下：

图1 亲本ZJU0116及其单细胞或原生质球S、候选突变体M1-3的光学显微形态

图2候选突变体MI-3及其亲本ZJU0116在不同温度下的生长曲线

图3 ZJU01 16(LMTA)及其亲本ZJU0116的RAPD电泳图谱

实验证明，选择适宜的诱变材料和诱变因子及其剂量是诱变育种成败的关键。螺旋藻对由物理、化学、 生物等因子引发的DNA损伤 ,还具有超强的修复功能,这主要源于螺旋藻基因组上存有大量的重复序列及强大的核酸酶系统。基于螺旋藻的上述生理生化与分子遗传学特性,研究利用化学因子EMS和物理因子γ射线复合诱变处理螺旋藻单细胞或原生质球,比用单一的EMS和NTG等化学因子及γ射线、Uv等物理因子处理螺旋藻藻丝或单细胞的诱变效果好。这一方面是因不同性质诱变因子的相互配合,不仅可减缓损伤,还可提高突变频率;另一方面是因游离的单细胞或原生质球一旦发生突变,比串连在藻丝上的突变细胞,更易分离出来。

目标突变体的筛选方法是诱变育种成败的另一关键。已有筛选螺旋藻等温度适应型品种(系) , 均将诱变处理后的材料置于低温或高温等相应逆境下进行筛选。这种方法虽也可行,但会因诱变体系中含众多在设定逆境下仍能生存甚至缓慢生长的亲本或非目标突变体,而严重影响筛选效率。为此,研究在采用低温逆境筛选低中温适应型螺旋藻品系的同时,还在前期多次预试验的基础上,增加了5次冷/热骤变交替处理,使诱变体系中对温度响应慢的细胞或原生质球因受应激而损伤甚至解体,从而将能对温度快速响应的突变体筛选出来。

因目前国内外工厂化生产螺旋藻,普遍采用的是带藻液环流装置、露天或盖有塑料薄膜/玻璃、面积300-700 m2的跑道式培植池。这种模式的培植温度和光照随季节和气候变化大,因而选育光温适应性好的品系，是实现螺旋藻低成本高产优质高效生产的重要前提。本研究建立的温度适应面评价螺旋藻品系生产性状的方法,比之前采用在某一低温度下测定生长量或光台放氧活性等评价方法,更合乎当前工厂化培植模式的生产良种选育实践。

研究针对国内外螺旋藻产业需求,在构建低温逆境筛选±冷/热骤变交替处理及温度适应面评价等方法的基础上,利用化学和物理因子复合诱变处理螺旋藻单细胞或原生质球,育成了1株最适生长温度为27℃、藻丝长度约500 μm、温度适应面和平均日产量依次提高10.7%和10.9% ,且己成功应用于工厂化生产的低中温适应型钝顶螺旋藻新品系ZJU0116(LMTA)。ZJU0116(LMTA)对切实推进当前螺旋藻产业种质更新、提质降本增效,具有重要意义;所建的技术与评价方法为其他经济生物温度适应型新品种(系)选育,提供了有意借鉴。

钝顶螺旋藻低中温适应型新品系的选育及RAPD分析_卢奇奇.pdf