微藻( microalgae )是指在水中浮游生活只能在显微镜下观察到的单细胞藻类,富含蛋白质、 脂类、矿物质元素、碳水化合物等营养物质和虾青素、多不饱和脂肪酸、色素等生理活性物质。微藻在水产养殖中应用广泛,可作为生物饵料和水产饲料添加剂、调控水质、疾病防控等,能够净化水质为水产动物提供优质的水环境,能抗菌减少水产动物疾病的发生,同时创造了巨大的经济利益。目前,生产上常用的饵料微藻主要有硅藻、金藻、绿藻等,他们为水产动物发育的不同阶段提供了丰富的营养物质。其中球等鞭金藻(Isochrysisgalbana)8701、青岛大扁藻(Platymonashelgolandicavar.tsingtaoensis)和牟氏角毛藻(Chaetocerosmuelleri)属于优质微藻饵料。该实验探究了电解沙滤海水培养球等鞭金藻8701、青岛大扁藻、牟氏角毛藻3种微藻与同传统漂白粉消毒的沙滤海水以及煮沸的沙滤海水培养微藻的生长情况是否存在差异。水产养殖生产中广泛使用的是有效氯含为28% ~ 35%的漂白粉,其价格低廉,杀菌效果好,但是漂白粉易受环境因素的影响造成有效氯分解。另外,漂白粉的粉尘和放出的氯气对人体和养殖对象有一定的毒副作用,所以使用过程中必须注意合适的浓度和正确的操作方法。煮沸是一种便捷、消毒速率快、杀菌效果好的消毒方式,但不适合用于微藻的二级、三级培养沙滤海水的消毒。电化学氧化水作为一种新型的广谱消毒剂和清洁剂,已有研究报道了电化学氧化水K在循环水养殖系统、生鲜食品、废水处理等域水处理和消毒效果。JORQUERA等通过不同技术对水进行消毒的实验发现,电化学处理的海水并不对球等鞭金藻8701的生长速率产生有害影响,并且微藻的生长速度比传统的高压灭菌海水或者杀菌紫外线处理后的海水要快。电化学氧化水是通过特制的电极电解沙滤海水产生有效氯,杀死海水中的细菌以及浮游生物等。随着电化学氧化水出水后静置时间增加,杀菌率大大提高。电解氧化法处理海水存在优势,海水含盐量高使其导电率高,减少了能耗。较高的氯离子浓度会间接促进氧化反应发生,还能在处理过程中控制电解条件来避免氯气的产生,即使用电解氧化法处理海水技术操作简便,二次污染物少,易于控制且不存在潜在危险化学药品对人的伤害等优点。该实验将电解氧化技术处理沙滤海水、漂白粉消毒沙滤海水和煮沸沙滤海水用于培养球等鞭金藻8701、青岛大扁藻、牟纸角毛藻,并对微藻生长情况进行对比分析,以探究电解氧化技术处理的沙滤海水替代煮沸和漂白粉消毒的沙滤海水用于微藻的一级、二级、三级培养的可行性,为使用电解氧化技术处理沙滤海水培养微藻规模化生产提供理论依据。
不同消毒海水的制备:电化学氧化水的制备,利用次氯酸钠发生器产生电解氧化水EOW250(有效氯浓度为250mg:L-4) ;电解氧化沙滤海水的制备用二级沙滤海水按比例稀释电解水为电解氧化水EOW10o(有效氯浓度为100mg:L-1) ;漂白粉消毒沙滤海水制备,使用菱湖牌漂白粉(有效氯浓度为28 ~ 35mg:L-1)处理沙滤海水;煮沸的沙滤海水制备,将沙滤海水加热煮沸。
余氯的测定:测定电化学氧化水、漂白粉处理过的沙滤海水中的余氯参考刘斌杰的方法。培养液母液的配置:硝酸钾100g ,磷酸二氢钾10g ,柠檬酸铁3 g,-水合硫酸锰0.3g ,乙二胺四乙酸二钠5g ,维生素B10.5mg , 维生素B120.1g ,硅15g (牟纸角毛藻)纯净水1000mL.标准曲线的绘制:藻细胞密度与光密度有一定的线性关系 ,将藻液稀释成浓度梯度,用普析通用T6紫外可见分光光度计,在680nm测定藻液的吸光度( OD) , 用血球计数法计数,用乙醇将藻固定,至少计数3次。以OD ( 680nm )为横坐标,细胞密度104cell-m-1为纵坐标作图,建立细胞密度与吸光度标准曲线。
球等鞭金藻、青大扁藻、牟氏角毛藻的培养3种藻种,分别设置电解氧化水EOW250(有效氯浓度为250mg-L 1)、电解氧化水EOW10o(有效氯浓度为100mg:L- 1)、漂白粉消毒的沙滤海水、煮沸的沙滤海水4组。实验准备36个5000mL的烧瓶,将烧瓶进行灭菌处理。灭菌后,每个实验组的烧瓶加入电解氧化水(有效氯浓度为250mg-L-1)、电解氧化水(有效氯浓度为100mg:L-1 )、漂白粉消毒的沙滤海水(有效氯浓度为35mg-L-1 )、煮沸的沙滤海水每瓶3000mL ,每个实验组设置3个平行,静置24h。在第2天接种前,使用N,N-二乙基对苯胺( DPD )比色法测定每个烧瓶的有效氯浓度,加入适量的硫代硫酸钠中和,测定有效氯浓度为0时,加入5mL培养液母液。取处于对数生长期的藻种接种,海水:藻液=2 : 1。球等鞭金藻8701培养温度18±1°C ,光照强度4000 ~ 16000lux ,光暗周期12h: 12h ,每隔4h摇一次烧瓶。青岛大扁藻培养温度22±1°C ,光照强度4000 ~ 16000lux ,光暗周期12h: 12h, 于青岛大扁藻对强光有背光性,对弱光有趋光性，每隔2h摇一次烧瓶。牟氏角毛藻培养温度28±1°C ,光照强度4000 ~ 160001ux ,光暗周期12h: 12h ,每隔4h摇一次烧瓶。培养过程中不充气,每种藻类实验周期为10d。
藻细胞密度的测定: 每隔24h取样一次 ,取样前将藻液混匀,使用普析通用T6紫外分光光度计测定藻液的吸光值, 利用标准曲线算出藻细胞密度,同时在400倍镜下采用血球计数板计算藻细胞数量。藻液中细菌数量的测定:在接种起始,使藻种与培养液混匀,取样测定藻液中的细菌数量。在实验结束,测定藻液中细菌数量。在这过程中使用稀释涂布平板法。
比生长速率的计算:根据标准曲线计算出藻类细胞数量,通过公式计算比生长速率:
μ= ( lnNt -lnwo) /t。
式中, Ng指初始藻类细胞数量，t指培养时间，Nt指t时间后藻类细胞数量。实验后，利用origin2021作图分析,利用SPSS 23.0对数据进行方差单因素分析,并采用LSD多重比较,显著水平设置P <0.05 ,数据以平均值±标准差表示。
饵料微藻细胞密度在0D680的拟合分析
采用分光光度计在680nm下测定球等鞭金藻8701、青岛大扁藻、牟氏角毛藻藻液的吸光度,以细胞密度( 104cell.mL-1 )为纵坐标,以分光光度计测得的吸光度为横坐标建立线性曲线,吸光度在0-0.8为线性范围。3种饵料微藻不同浓度藻液的吸光度均与细胞密度呈线性关系,相关系数均大于0.99.如图1所示,球等鞭金藻8701细胞密度吸光度标准曲线为y=6.89x 106x+0.32x104
图1球等鞭金藻8701标准曲线
图2大扁藻标准曲线
图3牟氏角毛藻( Chaetocerosmuelleri )标准曲线
微藻的生长曲线
根据线性公式计算球等鞭金藻8701每天的藻细胞密度并绘制生长曲线,如图4所示,在不同消毒技术处理下的沙滤海水中培养球等鞭金藻8701 ,初始细胞密度的范围为116.3x 104-146.7x104ellmL-1 ,细胞密度在10d内均持续增加至终密度。EOW100组生长最佳，漂白粉组次之,最差的是煮沸组和EOW250组。EOW1oo处理的细胞终密度可达437.7x 104cell-mL-1 ,而EOW25o组球等鞭金藻8701的细胞终密度只有345.3x1042l-.mL-1。如表1所示,球等鞭金藻8701各处理组的藻细胞终密度, EOW250组低于其他3组,而E0W10o与漂白粉组不存显著差异(P>0.05) ,但与煮沸组存在显著差异(P<0.05 ) , 漂白粉组与煮沸组不存在显著差异(P>0.05)。
图4 各处理组球等鞭金藻8701生长曲线
沙滤海水经不同的消毒技术处理后培养青岛大扁藻的生长曲线见图5。青岛大扁藻的藻细胞终密度最可达90.7x 104ell-mL-1，最低为81.0x104cell.mL- 1。经过方差分析各处理组之间藻细胞终密度无显著性差异(P>0.05)。
图5 各处理组青岛大扁藻生长曲线
沙滤海水经不同的消毒技术处理后培养牟氏角毛藻的生长曲线见图6 ,由生长曲线可知,牟氏角毛藻培养第1天生长迅速,曲线斜率较大,之后曲线斜率减缓,除电解氧化水EOW250组以外各组均进入匀速生长期。0-1d ,各组细胞生物量差异不明显。电解氧化水EOW250组在培养2d时,藻细胞密度达到210.7x104ell.mL-1 , 总体呈下降趋势,藻细胞终密度衰退至192.3x 104ell:mL-1,其余几组一直呈上升趋势。其中漂白粉组藻细胞终密度可达331.7x104ell-mL-1 ,电解氧化水KEOW100组次之,达到321.3x 104ell-.mL-1 ,煮沸组达到309.3x 104cell-mL-1.经检验分析, EOW250与其他3组处理组存在显著性差异(P <0.05)。
图6 不同处理牟氏角毛藻生长曲线
表1 不同处理微藻的藻细胞终密度(n=3)
沙滤海水消毒技术对饵料微藻24h比生长率的影响
沙滤海水经不同的消毒技术处理后,青岛馱扁藻、球等鞭金藻8701和牟氏角毛藻的比生长速率见表2。青岛馱扁藻比生长率最大为0.44h-1 ,最低为0.20h-1;牟氏角毛藻比生长率最大为0.50 h-1,最低为0.37 h-1;球等鞭金藻8701比生长率最大为0.45h-1,最低为0.20 h-1;如表2所示,电解氧化水EOW25o处理组的24 h比生长速率高于漂白粉组和煮沸组,即实验前期电解氧化水EOW25o处理组的藻生长速度高于漂白粉组和煮沸组。
表2 不同处理组微藻的24 h比生长速率(n=3)
沙滤海水消毒技术对藻际细菌总数的影响
如表3所示,在球等鞭金藻8701培养初期,各处理组的细菌总数无显著性差异(P>0.05)。当球等鞭金藻8701培养至第10天时,各处理组的细菌总数均明显下降, EOW25o组降幅高达88.97%。经检验分析,漂白粉组最终的细菌总数与电解氧化水KEOW250、电解氧化水KEOW100、煮沸组存在显著性差异(P <0.05)。
表3 球等鞭金藻8701各处理组的初始细菌数量与最终细菌数量( n=3 )
如表4所示,在青岛大扁藻培养初期,经检验分析各处理组的细菌总数无显著性差异(P>0.05)。当青岛大扁藻培养至第10天时, EOW250与EOW100组的细菌总数均明显增加,煮沸组的细菌总数略有增加,仅漂白粉组的细菌总数有较明显下降,降幅为43.26%。经检验分析, EOW250、EOW100 与漂白粉组存在显著性差异(P <0.05)。
表4 青岛大扁藻各处理组的初始细菌数量与最终细菌数量(n=3)
不同消毒技术对微藻生长的影响
实验结果表明,电解氧化水KEOW250与EOW1oo组较漂白粉组和煮沸组对于培养球等鞭金藻8701来说,电解氧化水前期比生长速率均大于其他两组,但最终细胞密度: EOW100>漂白粉>煮沸> EOW250 ;表明EOW250组与EOW100、漂白粉组存在显著性差异(P<0.05) , EOW100较EOW25o更适合用于培养球等鞭金藻8701。
对于培养青岛大扁藻来说,电解氧化水组前期比生长速率均大于其他两组,而最终细胞密度:煮沸>漂白粉> EOW250> EOW100;经过统计分析,各处理组对培养青岛大扁藻的藻细胞终密度无显著性差异( P>0.05 ) ,表明电解氧化处理法完全可以替代常规的青岛大扁藻培养海水消毒方法，且完全可以用低浓度EOW1oo处理。
在培养牟氏角毛藻时,漂白粉组与煮沸组前期比生长速率均大于电解氧化水组。电解氧化水EOW25o组 藻细胞终密度衰退至192.3x104ell.mL-1 ,为各组最低,推测电解氧化处理可能影响了海水正常组成成分。根据各处理组对饵料微藻24 h比生长率的测定显示,电解氧化处理组在24h内微藻都能快速繁殖,分析认为是由于电解氧化组对海水成分的破坏。由于营养盐的添加,微藻培养初期生长繁殖并没有显现,随着培养时间延长,海水成分的破坏最终影响了微藻的生长。最终藻类浓度结果:漂白粉组> EOW100>煮沸> EOW250 ,统计分析EOW25o组与其他处理组存在显著性差异(P <0.05) ,而其他处理组差异不显著, 表明电解氧化组在低浓度EOW1oo条件下完全可以替代常规的海水消毒处理方法来培养微藻。
细菌数量不同结果讨论
微藻在生长繁殖过程中分泌的多肽、多糖、维生素、脂、毒素等多种代谢产物以及促生长因子和抑制生长因子等,使得藻细胞周围形成特殊的微环境一藻际环境。一些微藻的伴生 细菌在促进微藻生长等方面起到重要作用,伴生细菌通过分解微藻细胞外产物从而产生了某些分泌促生长因子和无机营养盐促进微藻的生长。实验结束时球等鞭金藻电解氧化EOW25o处理组的细菌总数较培养第一天相比降幅最高,但EOW25o处理组藻细胞终密度是各处理组中最低。笔者认为电解氧化法处理影响了海水的正常组成成分，导致一些金藻的伴生细菌无法生存从而影响了金藻的生长繁殖。孔周雁的研究表明,球等鞭金藻一、二、三 级培养组的藻际细菌群落组成差异明显,而藻际细菌群落多样性可能与微藻生长存在一定相关性。青馱扁藻电解氧化水EOW250、EOW100组 与煮沸组最终细菌总数均有所增加,仅漂白粉组有所降低,但各处理组的最终藻细胞密度无显著性差异( P>0.05)。研究证实了某些异养细菌为绿藻提供B12 ,而绿藻为其提供固定碳。这种关系可能是影响微藻生长繁殖的原因之一。牟氏角毛藻EOW25o处理组细胞密度于第2天增长至210.7x 104ell-mL-1后衰退至192.3x 104ell.mL-1 ,可能是电解氧化法破坏了海水的正常组成成分,导致牟氏角毛藻无法正常生长繁殖。而EOW100、 漂白粉与煮沸组藻细胞终密度无显著性差异( P>0.05 )。本研究仅探讨了实验结束时不同饵料微藻各处理组中的细菌总数,尚未深入研究不同饵料微藻的细菌种类和优势菌群。
研究表明,当有效氯浓度为5mg:L-1 , 光合细菌、枯草芽孢杆菌、副溶血弧菌、硝化细菌在10min内被全部杀死。大肠杆菌、金黄色葡萄球菌在有效氯浓度为100mg-L 1的消毒水作用下, 15min后杀灭率均达到99.9% ,即电解氧化水EOW25o和EOW100组的杀菌效果显而易见。
综上所述,经电解氧化法处理后的沙滤海水(其有效氯浓度在250mg-L-1 )可用作于青岛大扁藻的培养,而经电解氧化法处理后的沙滤海水(其有效氯浓度在100mg:L-1 )可用作于球等鞭金藻8701、青岛大扁藻、牟氏角毛藻的培养。研究表明,电化学氧化法是一种有效且成本相对较低的消毒水处理方法,其电解氧化水于对微藻生长并无影响,可用于微藻大规模培养。用电解氧化法处理沙滤海水和常规的海水消毒方法培养球等鞭金藻8701对藻液最终细菌数量都有抑制效果,表明可以用电解氧化法代替常规的海水消毒方法处理的沙滤海水来培养球等鞭金藻8701.
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