微观藻类(微藻)是最古老的低等水生生物之一，其结构简单,个体微小,有单细胞或多细胞(丝状体、膜状体)2种类群，需要借助显微镜辅助才能观察其形态。微藻种类繁多,分布广,生活史丰富，适应能力强，能进行光合作用，能在多种极端环境如高盐或者高温环境下生存，是最简单的初级生产者。目前，微藻能通过代谢合成多种生物活性物质，如蛋白质、脂肪酸、维生素、色素、甾醇、多酚、黄酮、萜类、多糖等。微藻不仅在医药保健，食品研发，环境保护，工业生产，土壤改良，生态系统恢复等诸多方面均有应用，同时微藻作为基因工程受体而得到广泛关注，与高等陆生植物相比，微藻结构优势更利于操作,繁殖更快，光台效率更高，单位面积产量是陆生高等植物的若干倍。与模式生物大肠杆菌相比，微藻表达产物更易纯化，不含包涵体，更加安全无内毒素与外毒素产出，其培养基为简单的无机盐，更利于培养。与病毒相比微藻作为基因工程的载体更加易合成，免疫排斥反应低，转化承载能力更强。

随着人们对微藻基因工程的不断深入研究，微藻在基因工程的应用越来越受到人们的重视，目前能够成功高效转化的微藻种类并不多，因此开发更加有效的转化方式是十分必要的。现有的转化方式多为玻璃珠法，电击法，基因枪法，农杆菌介导法等。

01 玻璃珠法

目前使用最广泛的将目的基因转入微藻的方法是玻璃珠法。其原理是利用玻璃珠漩涡震荡时产生的瞬间切力将目的基因导入微藻细胞中。1990年Kindle等首次提出衣藻的细胞核核转化技术，并发现玻璃珠转化的效率与微藻生长状态有密切联系：当微藻生长到达指数生长期时(1x10⁶个·mL^-1），外源基因与微藻的比重达到2μg:3x10⁷个时转化效率最高。同时,实验中使用双质粒与玻璃珠共同转化，并发现使用双质粒的共转化会使外源基因插入载体频率变高,得到转化微藻更加容易。黄非等利用玻璃珠法对莱茵衣藻精氨酸缺陷型转化体系进行优化,转化具有35S启动子及GUS标记基因的pB1221质粒,发现质粒2μg,微藻个数达到3x10⁷,30min, 37℃预处理并震荡30s时转化率较高，同时微藻的细胞完整性较好。玻璃珠法高效便捷，成本低廉，对实验室级别没有较高的要求。但是玻璃珠法的操作对象只针对于缺壁的微藻细胞或者原生质体，对于带有细胞壁藻类转化效率较低。

02 电击法

电击法就是电穿孔法，当微藻的细胞受到瞬间脉冲电场的作用时会发生细胞膜透化，细胞膜产生可逆微孔通道，外源基因通过微孔进入微藻细胞，从而实现外源基因与微藻基因组的整合。

研究表明，当对电击条件进行改良后如脉冲强度，脉冲时间等，电击法的转化效率是玻璃珠法的2倍，同时通过电击法导入的外源基因包容性更高，能接受更长的目的片段导入。用电击法转化微藻时发现外源基因的浓度与转化效率成正相关。宋程飞等在VsDGAT1a基因导入杜氏盐藻时,以pCAMBIA3301为载体,发现当电击参数为0.4Kv和4ms时,转化效率是现有转化条件的1.14倍,微藻转化率为2.26%。这说明电击法的参数对外源基因导入微藻的效率起着决定性作用。刘佳等在利用电击法探究莱茵衣藻转化最佳条件时,将外源基因与绿色荧光蛋白(GFP)组合，转化结果可直接用肉眼观测，这将为电击法的不断优化提供新思路。

电击法操作简单，与玻璃珠法相比，电击法不仅可以作用于缺壁细胞，同时可作用于完整的带壁的微藻细胞，转化范围更加广泛。然而由于电击条件影响因素较多,受体细胞致死率较高,对外源基因的用量较大，稳定性与实验的重复性较低。

03 基因枪法

基因枪法是粒子轰击法的别称，其原理主要是利用:金或钨将外源基因包裹在内形成金属微粒,利用动力系统,在氦气的驱动力作用下将其高速打入受体细胞内。

Klein等最早利用此方法将烟草的RNA导入植物细胞中，此后，陆续将该方法用于微藻的转化之中。Wannathong等利用此方法在绿藻中实现了生长激素的合成。Kindle等将nit1转入衣藻中，Debuchy也实现了ASL对衣藻的转化。闫晋飞等将外源基因通过基因枪的方法转入雨生红球藻。陈禹先等对基因枪法进行优化，在三角褐指藻转化中调整目标载体0.75mg轰击量，轰击间距A-C分别是6.35mm，11mm， C为6cm时转化效率最高，使转化效率提升4.730倍。此转化参数同样适用于杜氏盐藻、小球藻的转化，为微藻基因工程技术提供更加可靠的转化技术。

但使用基因枪法得到的转化藻不稳定，会出现基因突变或部分基因沉默等不利于外源基因在靶细胞内稳定表达的现象。同时,该方法受到微粒的性质、大小和速度、到固定细胞的距离、要轰炸的细胞数量、重组质粒的线性化或环状形式以及靶DNA的浓度等多因素影响，可重复性低，使用具有一定局限性。

04 农杆菌介导法

农杆菌介导法的原理是用将外源基因插入Ti质粒中，再利用农杆菌的侵染作用将带有外源基因的Ti质粒插入受体细胞中，农杆菌介导法多用于植物基因工程的转化中，也可用于衣藻的细胞核转化中。结果显示，该转化方法在莱茵衣藻的细胞核转化中是玻璃珠法的50倍，学者在利用农杆菌转化异养蛋白核小球藻时对转化条件进行优化，调整菌液初始吸光度0D600nm为08，藻液浓度107个mL^-1 ,调整培养基酸碱度到pH=54后,仅2d便可以看到清晰的转化子，转化时间比使用自养微藻缩短3-5倍。虽然该方法与其他方法相比在使用过程中会出现转化子假阳性的可能行更高，但因成本低廉，可重复性强，周期短，基因沉默效应较低的优点而受到青睐。

05 其他

除去上述比较常用的转化方法外，也有一些其 他微藻转化方式。Debuchy等利用 显微注射法将ARG7基因导入微藻之中,使精氨酸缺陷型藻株恢复产精氨酸的能力。学者运用转座子的方式向浮丝藻中mcy基因插入转座子ISPIr1 ,探究转座子ISPIr1与mcy基因的密切联系。人工转座子的原理是将转座子与转座酶的组合，将外源基因插入微藻靶细胞。此外，利用Cre/loxP重组酶系统可将外源基因与抗性标记整合,解决了含有多个转基因的大质粒往往因为缺乏或不合适的酶切位点而不能转化的难题。同时，碳化硅细丝转化法、脂质体法、 纳米颗粒法、超声波法等方法也被用于微藻的基因工程中。随着基因工程的飞速发展,选择合适的外源基因转化方法,将为微藻改造提供更加便捷的操作,更加有利的条件。

全球已经有2万余种微藻种类被鉴定,除了较多种类的真核微藻如绿藻、硅藻、甲藻、褐藻外,还有种类较少的原核微藻，如蓝藻、念珠藻、鱼腥藻等。到目前为止，成功进行基因工程改造的微藻已经40多种,包括莱茵衣藻、普通小球藻、蓝藻等。原核微藻结构简单，与真核微藻相比更易操作。而真核微藻在细胞结构上更复杂，代谢途径更多样，分化成度更高。具有被核膜包被的细胞核、叶绿体、线粒体结构,这为微藻种质资源和性能的提升提供更多的可能性。

微藻种类繁多，不仅适应能力强，具有类似微生物的生长迅速的特点，同时又因为细胞器的存在,使其生理结构更加复杂，使微藻在拥有真核表达系统的同时又拥有原核表达系统。为了充分开发利用藻类的基因工程潜力,需要建立更加简化、灵活、高效的表达载体,并尝试不同组合的表达元件,更换不同类型的启动子或者复制子调控外源基因的表达。这需要研究者对微藻基因工程的调控机理进行更深入更广泛的研究，涉及到不同系统之间的调控，外源基因在微藻中表达所经历的表达过程，以及外源基因表达产物与微藻自身的相互作用。需要展开更细致的工作，建立新的体系，引入新的技术。

目前随着莱茵衣藻的全基因组测序完成，为莱茵衣藻基因I程改造提供更多操作上的选择性,成就了莱茵衣藻在藻类的合成生物学与系统生物学上的优势地位，莱茵衣藻已经成为微藻转化的模式生物。但是对于其他藻类的改造仍在起步阶段，与莱茵衣藻在基因工程改造方面仍然存在巨大差距，这极大限制了微藻基因工程改造的发展进程，不同微藻的遗传背景具有高度特异性，所以对于微藻的基因工程改造仍需要进一步探索，从实验室到工业化进程仍然有很大的进步空间。将新技术、新体系引入更多种类的微藻改造之中，是人们将面临的下一步挑战。