小球藻多糖( polysaccharide from Chlorella,PFC )作为一种天然来源的多糖,于其具有低毒性、低副作用和广谱效应的优势,近年来得到了大量学者的关注。其在降血脂、 抗肿瘤、 抗炎、抗帕金森、抗衰老等方面的功能已经体外和体内实验中得到初步的验证。但PFC作为人体免疫调节剂的相关研究仍然存在空缺。
人树突状细胞( dendritic cell,DC )是人体能力最强的专职抗原提呈细胞。于DC在人体内数量极少,通常使用细胞因子介导的体外诱导模型，即人外周血单核细胞来源DC(moDC)。体外诱导DC模型首次报道于1992年，即DC的传统培养体系,一般需要培养6-7d:用粒细胞一巨噬细胞集落刺激因子( GM-CSF)和白介素(IL)-4培养鼠骨髓细胞,可以获得不成熟状态的DC(PBS组) , 加细胞因子作为成熟刺激再培养1-2d ,以获得成熟DC。另一项研究报道,将纯化后的人CD14+细胞,用干扰素-β(IFN-β)或IL-4培养5d ,再加入肿瘤坏死因子-a(TNF-a)培养2d,获得高表达CD11c和CD83的DC ,具有更强的促进异体CD4+T细胞和CD8+ T细胞增殖的能力。众多天然来源的多糖具有良好的免疫调节活性,如目前已有香菇多糖、裂褶菌多糖、云芝多糖、猪苓多糖等药物应用于临床,能有效改善机体免疫功能,提高免疫力,并作为抗肿瘤的辅助治疗剂。然而,鲜见PFC作为人体免疫调节剂的相关研究报道。为此,本文对PFC促进moDC成熟的作用和相关机制进行初步研究,以评估PFC作为天然免疫调节剂的潜力。
●PFC溶液的制备
将纯化的PFC溶于无菌超纯水中,配置成1 mg/mL浓度。无菌超纯水将PFC稀释为0.1 mg/mL、1 mg/mL、10 mg/mL、100mg/mL 4种浓度。
●原代细胞培养
抽取无特殊疾病志愿者(平均年龄21岁)外周静脉血20 mL至EDTA抗凝管,用1xPBS和外周血1:1稀释。混合液与Lymphprep TM的比例为2: 1，使其分层,密度梯度离心法离心1500 r/min,20 min。离心后取自体血浆配置缓冲液(含有1%自体血浆和2 mM EDTA的PBS )和DC细胞培养基(含有10%自体血浆的RPMI-1640培养基) , 取白膜层细胞在缓冲液中重悬，1500 r/min室温离心5 min。用缓冲液将细胞浓度调整至1x108个/mL ,将细胞悬液转移至分选管。加入分选抗体100mL ,室温孵育10 min ,用缓冲液将悬液体积增加至2.5mL，将分选管放入磁铁，室温放置3min。弃上清,再重复该步骤两遍。用1mL含有10%自体血浆的RP-MI-1640培养基重悬管内细胞,进行细胞计数,将细胞浓度调整至8x105个/mL ,接种于48孔板中。采用rhGM-CSF(50ng/mL )和rhIL-4(10 ng/mL )联合培养, 37℃、5%CO2的孵育箱培养,于第5天获得PBS组;加入相同体积的PFC或LPS作为成熟刺激, 37℃、5%CO2的孵育箱培养24h ,于第6天获得成熟DC。培养后对其进行流式细胞术检测DC表型变化、酶联免疫吸附（ELISA）检测细胞因子水平变转录谱分析等，利用统计学进行数据分析。
经过对于PFC最佳浓度的测定、PFC上调了DC的cd83、CD86的表达等数据分析，得出实验结果如下：
图1桐浓度PFC干预下DC表面标志物CD83的表达水平( n=4)
图2 PFC干预后DC表面标志物CD83和CD86的表达水平( n=4)
图3 PFC干预后DC表面炎性细胞因子IL-10、IL-6和TNF-α的分泌水平( n=3)
图4 PFC干预DC后的差异基因表达和通路富集分析
图5 C29或TAK242对DC的细胞毒性影响和对C086表达水平的影响
图6 C29或TAK242对DC表面标志物CD86平均荧光强度的影响
由于人体组织中的DC比例极低,并且鼠DC和人DC存在物种间高度保守，为了解决DC产量低下导致的研究困难，已有研究进行了人外周血单核细胞来源DC的体外诱导模型研究，能够在较短的时间内获得具有良好免疫原性的DC。因此本研究使用传统的人DC体外诱导方法:即使用rhGM-CSF和rhIL-4体外联合培养,隔天换液,于第5天获得不成熟状态DC；在第6天按照分组分别加入等体积的PBS、PFC、LPS培养24 h作为诱导人外周血单核细胞来源DC的培养方案。
天然产物来源多糖作为免疫刺激剂具有低毒性、低成本等优点。经过前期实验,本课题组发现PFC对体外诱导的人外周血单核细胞来源DC细胞表面的成熟标志物CD83具有显著的提高作用,流式细胞术结果显示PFC在10μg/mL的浓度下干预DC 24 h后, DC表面的成熟标志物CD83的表达达到峰值，即DC进入成熟状态,由此本课题组确定了体外的诱导和干预方案。CD83是DC表面重要的成熟标志物, CD86作为DC表面重要的共刺激分子,充当DC激活T细胞活化的第二信号。两种标志物CD83和CD86表达的增强表明PFC促进人外周血单核细胞来源DC的成熟,提示PFC可能同时具有提高DC表面细胞因子分泌水平。因此,本研究通过ELISA评估DC分泌细胞因子IL-6、TNF-a和IL-10的水平。IL-10与DC的免疫耐受密切相关,具有免疫耐受的DC常用于肿瘤治疗,对治疗器官移植中的免疫耐受提供了潜在治疗思路;1L-6家族在先天免疫和适应性免疫、造血、抗炎方面起着重要作用；有研究表明, IL-6和TGF_β共同参与了Th17细胞的分化；在机体受到病毒入侵时, DC在响应病毒激活时产生的TNF-a作为自分泌成熟因子促进DC成熟,阻断TNF- a将使DC处于不成熟阶段,使DC无法充分发挥其抗原提呈功能。本研究中ELISA数据表明, PFC组的IL-10分泌水平和其他两组相比显著提高,提示PFC提高DC的免疫耐受;而IL-6和TNF-a的分泌水平提高趋势,提示PFC可能具有增强DC促进T细胞分化的作用。
已有文献报道TLR通路是天然产物多糖促进鼠DC成熟的重要靶点;结合转录谱Reactome通路富集分析结果可知，PFC干预后TLR相关基因的转录水平提高。因此本研究分别使用TLR2和TLR4通路抑制剂对PFC的对TLR通路的作用进行了验证。结果显示, PFC联合TLR2或TLR4通路抑制剂能够显著下调DC表面共刺激分子CD86的表达水平, TLR4抑制剂能够显著下调CD86的平均荧光强度,提示PFC通过TLR2和TLR4通路促进DC的成熟。然而CD86表达水平并未被完全消除,表明除了TLR信号通路外,还存在其他信号通路在PFC干预DC的过程中发挥作用,需要进一步挖掘。
在这项研究中,本课题组验证了PFC可以通过作用于TLR2和TLR4通路,促进人外周血单核细胞来源DC表面标志物CD86表达提高,从而促进DC成熟和抗原提星功能的提高。因此，PFC作为-种天然产物来源多糖，可能成为具有潜力的天然DC免疫调节剂。
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