雨生红球藻藻渣与2%Na OH溶液按照1 : 25(g/m L )的料液比混匀, 200 W超声破碎10 min,80℃水浴2 h,8 000 r/min离心10min取上清液,加入无水乙醇醇沉12h,离心( 8 000 r/min、10 min )取沉淀得到多糖提取物。对提取物进行多糖提取率的测定，采用设置对照组的方式，对藻渣进行测定，得出实验结果。

2.1葡萄糖标准曲线的绘制

葡萄糖标准曲线见图1。

图1 葡萄糖标准曲线

2.2单因素试验结果分析

NaOH质量分数对多糖提取率的影响见图2。

图2可知,随着Na OH质量分数的增加,多糖提取率呈先上升后下降的趋势，当Na OH质量分数为2.5%时,多糖提取率达到最大值。一方面 ,碱液提取有助于破坏细胞壁聚合物分子结构;另一方面,多糖在碱性条件下更易分离。适当的碱液有利于多糖从细胞中释放出来,从而提高多糖提取率。Na OH质分数大于2.5%时,多糖提取率开始下降。可能是Na OH质量分数过高,破坏了多糖结构进而对多糖提取造成一定损失。因此,根据试验结果,选择Na OH质星分数2.5%为中心试验点。

图2 NaOH质量分数对多糖提取率的影响

料液比对多糖提取率的影响见图3。

图3 料液比对多糖提取率的影响

由图3可知,在料液比为1 : 15(g/mL )时,多糖提取率为3.73% ,可能是溶剂添加量较低,碱液与多糖接触不充分,不利于物料内多糖分散到溶剂中,导致提取不彻底。料液比为1 : 20~1 : 25(g/mL)时,多糖提取率迅速增加;当料液比为1 : 25(g/mL)时,多糖提取率最高,为5.24%。料液比为1 : 25(g/mL)之后,多糖提取率逐渐下降。当料液比为1 : 30(g/mL )时,雨生红球藻藻渣多糖提取率为5.17% ,当料液比为1 : 35(g/mL )时,雨生红球藻藻渣多糖提取率为4.96%。可能是碱液过多, 导致多糖降解,从而降低了多糖的提取率。因此,根据试验结果,选择料液比1 : 25(g/m L )为中心试验点。超声功率对多糖提取率的影响见图4。

图4 超声功率对多糖提取率的影响

由图4可知,超声功率为100 ~ 250 W时,多糖提取率逐渐升高,其中超声功率为150 ~ 200 W时多糖提取率增加速度缓慢, 200- 250 W时多糖提取率急速增加，当超声功率为250 W时,多糖提取率最高,为5.10% ;随着超声功率继续增加,细胞破裂基本完全,多糖的溶出趋于饱和,再继续增大超声功率,多糖溶出也不会再增加,反而会导致其他非糖物质溶出,对多糖结构造成破坏,导致多糖提取率降低。因此,根据试验结果,选择超声功率250 W为中心试验点。超声时间对多糖提取率的影响见图5

图5 超声时间对多糖提取率的影响

由图5可知,不采用超声辅助提取得到的多糖提取率最低,超声时间为0~ 5 min时,多糖提取率由3.27%迅速提升到4.19% ,说明超声辅助提取有利于细胞破碎,使多糖提取率提高。随着超声时间的延长,多糖提取率随之增大,当超声时间为10 min时,多糖提取率为4.24% ,此时雨生红球藻藻渣多糖提取率达到最大值。在15 min时雨生红球藻藻渣多糖提取率迅速下降,提取率为3.83% ,在20min时雨生红球藻藻渣多糖提取率为3.08% ,在细胞完全破碎的条件下,继续延长超声时间,会对多糖的提取造成一定的损失,从而降低多糖提取率。因此,根据试验结果,选择超声时间10 min为中心试验点。提取时间对多糖提取率的影响见图6。

图6 提取时间对多糖提取率的影响

由图6可知,雨生红球藻藻渣多糖提取率存在最大值,当提取时间为1.0 h时雨生红球藻藻渣多糖提取率为1.74% ,当提取时间为1.5 h时雨生红球藻藻渣多糖提取率为2.86% ,当提取时间为2.0 h时雨生红球藻藻渣多糖提取率为3.16% ,当提取时间为2.5 h时出现最大值,此时雨生红球藻藻渣多糖提取率为4.68% ,当提取时间为3.0 h时,雨生红球藻藻渣多糖提取率开始降低,此时雨生红球藻藻渣多糖提取率为4.64%，可能是提取时间过短导致雨生红球藻藻渣多糖的提取不彻底,另外,碱液与多糖的接触时间过长,可能会破坏多糖结构,使部分多糖降解,对多糖提取率造成影响。因此,根据试验结果,选择提取时间2.5 h为中心试验点。

2.3 Plackett-Burman试验设计及结果

根据单因素结果设计Plackett- Burman试验,结果见表3。

表3 Plackett-Burman试验设计及结果

根据表3分析可得,第9组的多糖提取率最高 ,雨生红球藻藻渣多糖提取率为4.757%。对试验结果进行显著性及方差分析,结果见表4。

表4 Plackett- Burman试验方差分析

2.4 响应面结果与分析

利用Design- Expert软件的Box-Behnken法设计响应面试验方案,结果见表5。根据表5试验结果,运用Design-Expert 10.0.7软件对响应值进行分析,得到回归方程为Y=5.66-0.073X.+0.076X2+0.012X3+0.016XX2-0.26X1X3-0.21X2X3-0.77X2-0.43X2- 1.37X32

由表6可知,回归模型的P=0.000 1(P<0.01 ) , 对结果影响极显著,失拟项P=0.358 8(P>0.05 )不显著,说明该模型充分拟合试验数据,且眨未知因素影响小,不同因素对多糖提取率的影响顺序为料液比>提取时间>超声功率。该模型变异系数CV为5.28%<1R2Adj0%,R2为0.710 3与为0.813 2具有较好的一致性,即差值小于0.2 ,说明试验结果可靠性高,具有良好的相关性。建立三维数学模型预测因子交互作用与提取率的关系可知, 3个因素中任意两个因素的交互作用,均有最大值存在。

表5 Box-Behnken试验设计与结果

表6 回方程及方差分析

图7可知,提取时间一-定时,随着料液比增加,雨生红球藻藻渣多糖提取率先增大后减小,造成这一现象的主要原因可能是增大溶剂体积,增大了溶剂溶质接触的面积,使得更多的多糖被提取出来,但过多的溶剂并没有显著提高提取率,反而造成了资源的浪费;在料液比一定时,随着提取时间的延长,多糖提取率先增加后降低,这是因为多糖长时间在碱性环境中易分解;提取时间控制在2.4- 2.6 h,此时反应产物较稳定,最优提取时间为2.5 h。由等高线图可知提取时间方向等高线较为密集,表明料液比对雨生红球藻藻渣多糖提取率的影响比提取时间大。图7料液比与提取时间的交互作用当提取时间固定时,料液比与超声功率交互作用见图8。

图8可知,料液比一定时,随着超声功率的增大,雨生红球藻藻渣多糖提取率先增大后减小,过高的超声功率可能导致超声波的剪切强度增加,进而导致糖苷键化学结构发生断裂,使得多糖提取率降低,因此, 250 W为最佳超声功率;超声功率一定时,随着提取溶剂的增加,多糖提取率呈先升高后降低趋势,料液比为1 : 25(g/m L )时多糖提取率有最大值,继续增加溶剂体积,雨生红球藻藻渣多糖提取率开始下降, 表明此时细胞内外多糖物质已达溶解平衡。由等高线图可知料液比方向等高线较为密集,表明料液比对雨生红球藻藻渣多糖提取率的影响比超声功率大。

图8 料液比与超声功率的交互作用

当料液比固定时,提取时间与超声功率交互作用见图9。

图9可知,提取时间一定时,随着超声功率的增大,雨生红球藻藻渣多糖提取率呈先.上升后下降趋势;超声功率一定时,最佳提取时间为2.5h ,当提取时间为3.0 h时,雨生红球藻藻渣多糖提取率开始降低,推测原因可能是过多的溶剂在提取有效成分的同时,也会增加其他可溶性成分的溶出,过长的浸提时间可能导致部分多糖降解为低聚糖、寡糖或单糖,造成多糖提取率下降1。由等高线图可知提取时间方向等高线较为密集,表明提取时间对雨生红球藻藻渣多糖提取率的影响比超声功率大。

2.5响应面结果验证

根据软件预测雨生红球藻藻渣多糖最佳提取方案为料液比1 : 24.763(g/mL)、超声功率250.113 W、提取时间2.543 h,得到多糖提取率为5.666%。根据实际将条件调整为料液比1 : 25(g/mL)、超声功率250 W、提取时间2.5h ,在此条件下,得到多糖提取率为( 5.744+0.030）% ,这和预测值5.666%较接近,因此该模型可较好地预测和模拟雨生红球藻藻渣多糖的提取率及最佳的提取工艺。

2.6藻渣多糖紫外光谱分析

藻渣多糖紫外光谱见图10。

2.7藻渣多糖的红外光谱分析

藻渣多糖的红外光谱见图11。

图11 雨生红球藻澡渣多糖红外光谱

如图11所示, 3 405.28 cm-1处出现的吸收峰是由于OH-的伸缩振动引起的1221,2 931.28 cm-1是C一H的特征吸收峰，1 645.45 cm-1附近的吸收峰为C O的非对称伸缩振动峰,说明存在糠醛酸;在1 155.12、 1 081.40、 1 024 cm-1处分别是C-O-C、C-0-H、C-C的伸缩振动吸收峰,说明雨生红球藻藻渣多糖具有吡喃环结构;D-吡喃葡萄糖的吸收峰在930.87 cm-1,849.80cm- 1是a-型糖苷键的特征吸收峰。综上所述,雨生红球藻藻渣多糖为含有吡喃环结构a:型多糖。

2.8藻渣多糖对胰脂肪酶抑制作用

藻渣多糖对胰脂肪酶抑制作用见图12。

图12 雨生红球藻澡渣多糖对胰脂肪酶的抑制率

图12可知,随着多糖浓度的增加雨生红球藻藻渣多糖对胰脂肪酶抑制作用呈上升趋势,多糖浓度从0.5 mg/m L增加到3 mg/m

L时,对胰脂肪酶的抑制率迅速上升,从3 mg/m L增加到5 mg/m L时,增长速度减缓。当多糖浓度为5 mg/m L时,其对胰脂肪酶抑制率可达到(94.19±0.02)%。

本试验对雨生红球藻藻渣多糖的提取工艺及降血脂活性进行研究。结果表明, 藻渣多糖最佳提取条件为Na OH质量分数2.5%、超声功率250 W、提取时间2.5 h、超声时间10 min、料液比1 : 25(g/mL) , 在此条件下,多糖的提取率为( 5.744+0.030) %。提取的藻渣多糖有较好的降血脂活性,多糖浓度在5 mg/m L时,对胰脂肪酶活性抑制率达到( 94.19±0.02 ) %。