虾青素(Astaxanthin, AST)是-种在红色素中发现的类胡萝卜素凹。它分子结构独特，每一端都帶有一个羟基和酮基的B-紫罗兰酮环，这种结构使得AST既能提供电子也能吸引自由基。据报道，AST具有猝灭单线态氧的能力，拥有比维生素E和辅酶Q10更强的抗氧化活性，对心血管疾病、炎症等许多疾病也具有药理作用。研究发现AST还能够有效抑制转化生长因子TGF-B;引起的I型胶原蛋白 、波形蛋白和a-平滑肌肌动蛋白高表达。而且，AST在体内不会成为促氧化剂，能够有效清除活性氧(ROS)并减少氧化应激。此外，AST还可恢复紧密连接相关蛋白Z0-1和Occludin的表达，改善小鼠肠道屏障功能。
槟榔作为我国四大南药之首，全身都是宝，常以食用为主，是仅次于尼古丁、乙醇和咖啡因的世界第四大嗜好物品。由于用于咀嚼的槟榔纤维粗糙，长期嚼食易增加口腔黏膜下纤维化(Oral Submucosal Fibrosis,OSF)、口腔白班(Oral Leukoplakia, OLK)和口腔扁平苔藓(Oral Lichen Planus, OLP)等疾病的发病率。
研究表明，槟榔的多种活性成分和代谢产物都具有细胞毒性和遗传毒性，甚至有些成分具有致癌性。槟榔的主要生物碱槟榔碱(Arecoline，ARC) 也被认为是导致OSF的主要活性成分。高义军报导，30μg/mL的ARC即可诱导口腔黏膜角质形成细胞发生凋亡。同时，ARC还能诱发口腔黏膜上皮细胞ROS生成增多，从而诱导和激活关键的促纤维化因子TGF-B1。此外，ARC还通过损伤上皮屏障进一步侵害黏膜深层细胞，刺激肌成纤维细胞活化，促进胶原合成。因此对口腔黏膜上皮的保护至关重要。
早期生长反应因子1 (Human Early Growth Response Factor 1，EGR1)是锌指转录因子家族的成员之一，参与了细胞生长、发育、凋亡和分化过程04。据报道，EGR1是TGF-B1的下游调节因子，参与TGF-B信号传导过程，与TGF-Br之间可能存在反馈调节。体外研究表明，Egr1 可通过靶向TGF-B1启动子增强TGF-β信号传导，从而促进了大鼠肾小球系膜细胞中高糖诱导的增殖和上皮间充质转换。此外，Hsieh 等叼证明了EGR1在OSF组织中高表达，低剂量槟榔碱可刺激人颊黏膜成纤维细胞中EGR1上调。靶向MEG3/ miR-181a/Egr1轴也被证明可减轻肌成纤维细胞的活性。
目前，AST对嚼食槟榔人群的保护效应未见过多报道。本研究主要通过机械摩擦和ARC模拟人嚼食槟榔过程，建立大鼠口腔黏膜损伤模型，探索AST对大鼠口腔黏膜组织上皮菱缩和胶原沉积的影响:同时通过ARC体外诱导人正常口腔上皮角质(Human Oral Keratinocyte, HOK)细胞，探索AST对HOK细胞屏障功能、线粒体功能和EGR1的影响。为AST开发为保护嚼食槟榔人群口腔黏膜的功能性产品提供理论基础和科学依据。
21只SPF级雄性SD大鼠每天给予自由进食和饮水，适应性饲养一周后，随机分为正常组(Con)、模型组.(ARC)、给药组(ARC±AST)，每组7只大鼠。模型组中用6N的力使用尼龙刷摩擦大鼠两侧颊黏膜，随后两侧黏膜分别给予15 uLARC (18 mg/mL)溶液，隔天-次。给药组用蒸馏水稀释AST,按每天25 mg/kg灌胃AST, 持续灌胃20周。对大鼠的口腔黏膜组织病理检测以及免疫组化、线粒体超氧化物检测等数据进行归纳和分析。
2.1 大鼠口腔黏膜组织形态学变化
学者研究，大鼠口腔黏膜下注射ARC会促使口腔黏膜上皮萎缩，厚度变薄，上皮钉突扁平且数量减少，同时促使固有层胶原纤维大量堆积，排列紊乱。我们采用机械摩擦和ARC刺激大鼠的口腔黏膜也致使大鼠口腔黏膜损伤。从图1可看出，与正常组相比，模型组上皮明显变薄，钉突平缓。与模型组相比，AST干预组大鼠口腔上皮未见过分变薄，且仍维持上皮钉形状.初步判断AST可能对大鼠口腔黏膜上皮具有保护作用。
图1 大鼠口腔黏膜组织形态
2.2 大鼠口腔黏膜组织胶原纤维变化
ARC作用于口腔黏膜后可引起胶原代谢紊乱致使胶原蛋白在口腔黏膜中的沉积增加。研究表明，AST能够有效改善UUO小鼠胶原蛋白沉积，并降低CollagenI蛋白的表达。由图2a和c可看出，与正常组相比，模型组口腔黏膜组织固有层蓝色胶原明显增多，相对胶原面积显著升高26.14%，说明胶原代谢紊乱，胶原蛋白在固有层沉积增加，目标模型建立成功。与模型组相比，AST干预组的相对胶原面积显著降低9.84%,说明AST能够缓解ARC诱导的口腔黏膜组织胶原沉积.此外，与正常组相比，模型组中代表CollagenI的黄橙色和红橙色纤维面积明显增多33.43%，说明Collagen I在模型组口腔黏膜组织中堆积;而与模型组相比，AST干预组大鼠Collagen面积显著降低23.01% (图2b和d)。说明AST可通过减少Collagen I面积缓解胶原纤维在黏膜下更紧密堆积。
图2 大鼠口腔黏膜组织胶原纤维变化
2.3 AST 改善ARC诱导的HOK细胞屏障功能损伤
Z0-1和Occludin蛋白是构成上皮屏障紧密连接结构的重要蛋白，它们可通过保持上皮细胞彼此紧密连接来确保口腔.上皮屏障结构的完整性，具有调节离子和分子通过细胞旁通道的功能。Wei等1]研究发现，ARC可降低Occludin蛋白在HOK细胞中的表达，并干扰Z0-1和Occludin蛋白和在HOK细胞中的定位，从而破坏细胞的紧密连接结构。本研究通过免疫荧光检测AST对ARC诱导的HOK细胞内Z0-1和Occludin蛋白的影响。如图3所示，与正常组相比，模型组内可观察到Z0-1蛋白不能完全定位在细胞膜上，部分Z0-1蛋白聚集在细胞质中;而Occludin蛋白表达降低，也未能完全定位于细胞膜。与模型组相比，AST干预组的细胞中Z0-1蛋白在细胞质的聚集明显减少，Z0-1在细胞膜的蛋白定位增加，对Z0-1蛋白的表达水平没有明显影响，但增强了Occludin蛋白的表达和在细胞膜上的定位。这一结果说明AST可通过增强Z0-1和Occludin蛋白在细胞膜上的定位和提高Occludin蛋白的表达来改善ARC诱导的HOK细胞屏障功能损伤。
图3 AST可改善ARC诱导的HOK细胞屏障功能损伤
2.4 AST改善ARC诱导的HOK细胞线粒体功能损伤
ROS在多种口腔黏膜疾病发病机制中都起着重要作用。细胞内主要由线粒体产生ROS,从而激活特定通路促进疾病的发生。AST作为一种天然的强抗氧化剂，可轻易透过细胞膜定位于线粒体。研究表明，AST能够减少氧化应激来维持线粒体完整性，防止线粒体膜电位丧失，并增加线粒体的耗氧量从而抑制线粒体功能障碍。Sun的同样报道了AST能够抑制Sol8成肌细胞线粒体活性氧(mtROS) 的产生24。本研究中，在ARC的刺激下，模型组HOK细胞线粒体超微结构出现空泡化，线粒体嵴数量减少，膜电位(MMP)明显下降，mtROS 生成增多;相比于模型组，AST干预组能够有效保护线粒体结构正常，维持MMP，清除过多的mtROS (图4)。这提示AST能够改善ARC诱导的ROs生成增多，保护HOK细胞免受氧化损伤。
图4 AST可缓解ARC诱导的HOK细胞线粒体形态和功能损伤
2.5 AST可抑制ARC诱导的HOK细胞EGR1高表达
TGF-B是一类具有多种生物学功能的细胞因子，在OSF和OLP的发展中都起着重要的作用125.26。特别是TGF-B，对胶原蛋白生成和减少基质降解中发挥重要作用。EGR1是TGF-B1诱导的靶蛋白之一，学者的研究中，EGR1在OSF组织中高表达，ARC诱导的mtROS可通过激活潜伏的TGF-Bi促进EGR1合成，使.其参与TGF-B信号传导。除此之外，也有研究发现EGR1与ROS的生成有着密切联系，通过抑制EGR1可减少mtROS生成过多，改善线粒体功能损伤。本研究通过免疫组化检测了大鼠口腔黏膜组织中EGR1蛋白的表达水平，发现相比于正常组，模型组中EGR1蛋白表达水平增加，而AST干预组中EGR1蛋白的表达则下调(图5a)。为了进一步确定AST对EGR1蛋白的影响，本研究又通过体外细胞实验用ARC诱导HOK细胞，使细胞内EGR1蛋白表达水平增加。免疫荧光结果显示，相比于正常组，EGR1蛋白平均荧光强度在模型组中显著增加44.22%;而给予AST后, EGR1蛋白平均荧光强度则比模型组的下降了24.53%(图 5b)。这一*结果提示AST可抑制ARC诱导的HOK细胞内EGR1表达增加。此外，我们还探索了EGR1是否有可能成为AST的作用靶点。通过分子对接，我们发现AST与EGR1的对接结合能为一6.8697 kea/mol,存在两个氢键作用，说明两者之间可能存在潜在的相互结合作用(图6)。
图5 AST可抑制ARC诱导的HOK细胞EGR1蛋白高表达
图6 AST与EGR1的分子对接模型及分子对接2D图
综上所述，本研究发现AST能够改善ARC诱导的大鼠口腔黏膜组织上皮萎缩及固有层胶原沉积现象，通过体外细胞实验进一步验证 了AST能够改善ARC诱导的HOK细胞屏障功能和线粒体功能损伤，推测其机理可能是通过抑制EGR1改善ARC诱导的mtROS生成过多(图7)。本研究主要从效应指标上提示AST具有良好的保护咀嚼槟榔人群的口腔健康，可进一步开发成具有口腔保护功能的功能性食品。
图7 AST改善ARC诱导的HOK细胞上皮屏障和线粒体功能损伤
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