金刚虾为斑节对虾中南非群体,属节肢动物门 ,甲壳纲 十足目，对虾属具有肉质口感良好、经济效益高等特点，成为了近几年新兴养殖品种。随着集约化养殖的发展,对虾养殖产业对饲料添加剂的需求愈发旺盛,其中值得关注的是虾青素(astaxanthin)作为酮式类胡萝卜素,具有淬灭单线态氧的能力,拥有远超维生素E与类胡萝卜素β的抗氧化性能,以及在提升水产动物生长、抗病、繁殖等性能时所表现出的巨大潜力。
雨生红球藻是一种能够合成脂类和虾青素的单细胞绿藻,其类胡萝卜素次生代谢物中,虾青素含量超过80%,藻类整体虾青素积累水平为1%-3%，是目前天然虾青素的主要来源之一。众多研究皆阐述了雨生红球藻粉作为水产饲料添加剂所带来的积极影响,如改善网箱养殖中虹鳟的生长性能 ,激活金鲳鱼的核因子E2相关因子2( nuclear factor E2-telatedfactor 2,Nrf2) -抗氧化反应元件通路以增强其免疫性能，提升大黄鱼的生长性能和抗氧化性能等。在甲壳动物中,雨生红球藻同样展现出极佳的应用前景,研究发现其能够增加中华绒螯蟹和克氏原鳌虾各组织中类胡萝卜素的沉积水平,增强抗氧化性能。此外还能提升克氏原螯虾的抗低氧能力；同时发现添加适量雨生红球藻粉能够调节克氏原螯虾的肠道菌群,缓解肠道功能障碍,从而提升其生长性能;在南美白对虾( Litopenaeus Vannamei）和中华绒螯蟹中也发现雨生红球藻对于肠道菌群具有正向调节作用。
目前，饲料中添加雨生红球藻粉对金刚虾养殖的影响尚未得到研究。因此,本试验在基础饲料中添加不同水平的雨生红球藻粉，探究其对金刚虾生长性能、虾青素沉积水平、肠道形态及肠道微生物结构的改善情况，为雨生红球藻粉作为饲料添加剂提供科学依据。
选择1 620尾初始体重为( 2.38±0.25) g的金刚虾，随机分为9个组，每组3个重复，每个重复60尾虾。各组分别在基础饲料中添加0(A0组,对照组).0.1%( A1组) .0.2%( A2组).0.3%(A3组) .0.4%( A4组).0.5%( A5组) .0.6%( A6组)、0.7%( A7组) .0.8%( A8组)的雨生红球藻粉。试验期42 d。雨生红球藻粉为破壁后藻粉,虾青素含量为0.3%。以鱼粉、豆粕为主要蛋白质源，以鱼油、豆油和磷脂为主要脂肪源配制试验饲料鱼粉和豆粕经粉碎机粉碎后过60目筛,氯化胆碱、磷酸二氢钙、维生素预混料和矿物质预混料过60目筛,逐级混匀,再加入豆油、鱼油、磷脂再次混匀,加入30%左右的水拌匀，经双螺杆挤条机加工成直径为1.0 mm的长条状后手动搓成饲料颗粒,放置于电热鼓风干燥箱中45℃烘干，并于4℃冰箱保存待用。并对其实验对象进行虾青素含量、生长性能、肠道微生物等维度进行分析测定。
2.1 雨生红球藻粉对金刚虾生长性能的影响
由表2可见，随着雨生红球藻粉添加水平的增加,金刚虾终末体重、增重率和特定生长率先升高后下降,在A3组达到最大值,A2-A5组的终末体重和增重率显著高于对照组( P<0.05) ,A1-A5组的特定生长率显著高于对照组( P<0.05)。A1-A6组的存活率与对照组无显著差异( P>0.05)，A7-A8组的存活率显著低于对照组( P<0.05)。A2-A4组的饵料系数显著低于对照组( P<0.05) ,在A3组达到最小值。
表2 雨生红球藻粉对金刚虾生长性能的影响
2.2 雨生红球藻粉对金刚虾虾青素沉积的影响
由表3可见,A1-A8组的甲壳中虾青素含量均显著高于对照组( P<0.05) , 当雨生红球藻粉添加水平达到0.6%后,甲壳虾青素含量趋于稳定。A4-A8组的肝胰腺和肌肉中虾青素含量显著高于对照组( P<0.05) ,当雨生红球藻粉添加水平达到0.4%后，肌肉中虾青素含量趋于稳定。各试验组金刚虾甲壳中虾青素含量最高,肝胰腺中次之，肌肉中最低。A1-A8组的肝胰腺/甲壳和肌肉/甲壳虾青素比例均显著低于对照组( P<0.05)。
表3 雨生红球藻粉对金刚虾虾青素沉积的影响
2.3 雨生红球藻粉对金刚虾肠道形态的影响
由表4可见,A1和A2组的肠绒毛高度显著低于对照组( P<0.05) ,A4- A8组的肠绒毛高度显著高于对照组( P<0.05) ,A5组的肠绒毛高度显著高于其他各组( P<0.05)。A1-A8组的肠壁厚度显著高于对照组( P<0.05),A5组的肠壁厚度显著高于其他各组( P<0.05)。由图1可见,A1-A8组的肠绒毛柱状上皮细胞与对照组相比有所增多,环形肌层结构更为清晰。
表4 金刚虾中肠绒毛高 度和肠壁厚度
图1 中肠组织结构HE染色
2.4 雨生红球藻粉对金刚虾肠道微生物的影响
A8组进行肠道微生物分析。由图2可见，物种积根据以上研究结果,选择对照组及A2、A5、曲线趋于平缓,表明抽样数量足够,可以继续分析(图2-A)；主成分分析( PCA)显示各组金刚虾肠道菌群组成差异明显(图2-B);各组同有特征数目123个,A2、A5、A8组同有特征数目56个,对照组特有特征数目690 个(图2-C); A2、A5、A8组OTU数目随着雨生红球藻粉添加水平的增加而增多,A8组的OTU数目与对照组持平(图2-D)。
图2 样品特征序列分析
由图3可见,在门水平.上,各组肠道都以疣微菌门、 变形菌门、浮霉菌门( Planctomycetota) 为主, A2、A5、A8组的肠道菌门相对丰度分布比对照组更均匀。由图4可见,与对照组相比, A2、A5、A8组的肠道变形菌门相对丰度均显著降低( P <0.05) , 肠道疣微菌门、浮霉菌门相对丰度显著升高( P<0.05); A5和A8组的肠道蓝细菌门(Cyanobacteria)相对丰度显著升高( P<0.05)。由图5可见，在属水平上,A2、A5、A8组的肠道各菌属相对丰度分布更均匀。由图6可见,与对照组相比,A2、A5、A8组的肠道Haloferula、小梨形菌属( Pir4-ineage)、 芽殖小梨形菌属( Blas-topirellula)、 Bythopirellula相对丰度显著升高( P< 0.05) ,希瓦氏菌属( Shewanella)和弧菌属( Vibrio)相对丰度均显著降低( P<0.05); A2组的肠道Ru-britalea相对丰度显著升高( P<0.05);此外, A2、A5、A8组红杆小梨菌属( Rhodopirellula) 相对丰度升高,但无显著差异( P>0.05)。
图3 物种组成相对丰度柱状图(门水平)
Alpha多样性分析结果显示,随着雨生红球藻粉添加水平的增加，ACE指数和Chaol指数逐渐升高,且A5组ACE指数和Chaol指数显著高于A2组(P<0.05);Shannon指数和Simpon指数先升后降,且A2、A5、A8组的Shannon指数和Sim-pon指数显著高于对照组( P<0.05)。
图4 相对丰度显著性分析(门水平)
图5 物种组成相对丰度柱状图(属水平)
本研究结果显示,饲料中添加雨生红球藻粉投喂金刚虾后,能改善其生长性能。此前众多的研究都指出了雨生红球藻粉对水产动物生长性能有积极的影响。在硬骨鱼类中，研究发现饲料中添加0.17%-0.33%的雨生红球藻粉能够显著提高虹鳟终末体重,同时降低饵料系数;在软体动物中，研究发现饲料中添加0.75%- 1.00%的雨生红球藻粉能够显著提升方斑东风螺的增重率和特定生长率;在甲壳动物中,雨生红球藻粉同样表现出巨大的潜力,饲料中添加0.3%的雨生紅球藻粉可显著提升凡纳滨对虾的养殖产量国。雨生红球藻在整个生命周期中会生成类胡萝卜素代谢物,其中虾青素含量占据80%以上。
鉴于虾青素在各个领域的良好表现,很多研究者将雨生红球藻粉对水产动物生长性能的积极影响归功于此,有研究者将同样虾青素含量的雨生红红球粉和其他虾青素源添加到饲料中行养殖试验,发现养殖动物的生长性能没有显著差异 ,这也更加印证了此说法。此外，雨生红球藻粉添加水平的不同也会带来差异化影响。本试验中,雨生红球藻粉添加水平在0.2%-0.5%时,金刚虾生长性能显著提高:在此基础上继续加大添加水平时,增重率反面会有所降低.说明雨生紅球藻粉中某些物质在高水平的情况下对养殖动物生长性状的提升效果会减弱,这与其他研究者在饲料中添加雨生红球藻粉饲喂大黄鱼时其最适添加水平为0.28%- 0.56% 。在克氏原螯虾中其最适添加水平为0.15%-0.30%的结果基本相近。
①雨生红球藻粉可以提高金刚虾的生长性能,饲料中雨生红球藻粉添加水平0.3%时其增重率最高,饲料系数最低。
②雨生红球藻粉可提高金刚虾甲壳、肝胰腺与肌肉中虾青素沉积水平,不同组织的沉积能力有差异,表现为甲壳>肝胰腺>肌肉。
③雨生红球藻粉可以改善金刚虾肠道组织形态,增加肠绒毛高度、肠壁厚度和肠道微生物多样性,并且抑制弧菌属的相对丰度。
④综上所述,金刚虾饲料中雨生红球藻粉添加水平为0.2%-0.5%。
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