1.1材料与仪器

采用的Graesiella (油球藻属)分离自中国江西龙南某废弃稀:土矿区周边水体[6] ,用BG- 11培养基进行培养,实验采用模拟废水,成分如下: KH2PO40.01 g/L , MgSO4:-7H2O 0.01 g/L , NH4CI 0.3821 g/L, NaNO30.3036 g/L ,葡萄糖0.2 g/L , A5溶液1 mL/L,调节pH值为6.0 ,以保证氨氮、总氮、总磷为100、 150、 10 mg/L。配制1 g/L的Y3+储备液, 4℃避光保存,根据实验需要添加量。NaNO3、 K2HPO4、 CaCl2 ，MgSO4 ,柠檬酸,柠檬酸铁铵，EDTA-2Na、Na2CO3、 H3BO3、 MnCl2:4H2O、 ZnSO47H2O、CuSO4:5H2O、 CoNO3:6H2O、 NaMoO4:2H2O、 NaOH、HCI、 NH4C|、 葡萄糖、YCl3:6H2O、 H2SO4、 无水乙醇、苯酚均为分析纯。

常州高德GD-2102GZ光照振荡培养箱;普析通用T6新世纪分光光度计; PerkinElmer AvioTM 200电感耦合等离子体质谱仪(ICP) ;天津港东FTIR-850傅里叶红外。

1.2实验方法

1.2.1微藻培养

配制一定量BG-11培养基于500 mL锥形瓶,光照强度6000 Lux ,光暗比16 h:8 h ,温度26+1°C ,每日早晚定时摇晃锥形瓶1 h氮含量会影响藻细胞表面的官能团,设置两组培养条件,一-组 (N1 )富氮培养,在BG-11培养基的基础上将硝态氮增加至0.6 g/L，另一组(N2 )缺氮培养,硝态氮减少至0.05 g/L ,以保证必要氮源。

1.2.2稀土离子对微藻的影响

将油球藻加入到装有150 ml模拟废水的250 ml锥形瓶中, 40 kHz下超声处理1 min ,以分解悬浮生物质颗粒。初始浓度为0.2 g/L左右,废水pH值调至6.0+0.2以保证微藻生长。设置Y3浓度梯度为0、1、 5、10、 15 mg/L。实验设置10天,每天控制pH值在6.0左右,每2天测定微藻在680 nm波长下的光密度( 0D680)、光合色素、胞外聚合物( EPS) , 及水中Y³⁺浓度。分别在第0天,第5及第10天测定藻细胞中的抗氧化系统。

1.2.3两种培养方式下的吸附研究

实验在150 mL锥形瓶中进行,取0.1 g藻颗粒加入模拟废水中, 40 kHz下超声处理1 min ,并调节pH至5.5+0.2 ,并置于摇床中20℃恒温,转速设置为120 r/min ,分别加入Y3+母液,保证混合体积为100 mL, Y3+浓度为6、12、 24 mg/L,生物量为1 g/L。在2, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 90 , 120 , 240 min取2 mL藻液,另取0.1 g藻颗粒按同样方式处理,保证混合体积为100 mL，

γ3+浓度为5、10、 20、50、 100 mg/L ,分别于10 °C和30 °C摇床振荡90 min。经0.45 μm滤膜过滤后检测样品金属浓度,根据实验结果进行动力学,等温线和热力学分析,利用FTIR对表面官能团进行分析,探究微藻细胞吸附重金属的机理。所有实验一式三份。

1.3分析方法

1.3.1微藻生理指标和稀土离子的测定

通过分光光度法测量OD680 ,构建干重( Dry Weight )与光密度(OD680)的线性曲线:

Dry Weight(g/D) = 0.4207.0D680-0.0265,R2=0.995(1)比增长率p参考Wang等8研究方法,始色素测定采用95%Z醇法9。胞外聚合物( EPS )包括可溶性蛋白质和多糖,蛋白质采用考马斯亮蓝法测定,多糖采用苯酚硫酸法测定[10]。γ3+ 含量通过ICP测定,总抗氧化能力(T-AOC)、丙二醛( MDA )和谷胱甘肽(GSH )按上海生:工试剂盒说明书进行测定。

1.3.2吸附模型的建立

利用拟一级、拟二级动力学模型对油球藻吸附去除Y3 +进行拟合,采用Langmuir、 Freundlich和Sips模型用于表征平衡等温线，将标准吸附焓变( OH0)、标准吉布斯自由能( OG0 )和标准吸附熵( oSO )作为热力学模型,确定其吸附去除机制。

1.3.3微藻表征

将吸附前后的微藻细胞干燥得到藻粉,后进行扫描,通过OMNIC 9.2、Origin 2021进行数据分析处理以及图表绘制。

2.1 Y³⁺浓度对油球藻生长的影响

图1可知，10 mg/L以下时对油球藻有促进作用,特别是在5 mg/L时,微藻生物量达到了0.61 g/L ,比生长速率也达到了0.11 day-1 ,高于对照组0.53 g/L的生物量和0.1 day -1的比生长速率, γ3+在10 mg/L以下对油球藻没有明显抑制作用, 5 mg/L时的促进作用最明显。超过10 mg/L时开始明显抑制, 15 mg/L组的生物量下降至0.27 g/L,比生长速率也降至对照组的三分之一左右。微藻可以抵御短期的外部环境干扰,因此如果需要微藻在长期的环境干扰下耐受或继续生长,则必须对微藻进行模拟环境下的驯化培养,以提高藻细胞的应对能力。

图1  Y³⁺对油球藻生长的影响

叶绿素是光合作用的主要色素,可将光能转化为细胞生长所需的化学能和生物质能11。图2为不同Y³⁺ 浓度下油球藻中叶绿素a和叶绿素b含量变化,图2可知, 5 mg/L左右的叶绿素含量相比于对照组提高明显,说明低浓度的Y3+刺激微藻细胞生长,增强光合作用能力。Y³⁺ 增加至15 mg/L时,叶绿素的合成受到了明显抑制,尤其是在培养中后期,叶绿素a含量下降。叶绿素b的变化趋势也类似,低浓度Y³⁺下,各组叶绿素b含量均呈上升趋势,略有波动。5 m/L组的叶绿素含量相较于对照组增长变化最显著,在培养结束时比空白对照组提高了23.74%和31.41%。Y3+浓度在10 mg/L以上时,过高的浓度导致微藻死亡,叶绿素含量快速下降。

图2 不同Y³⁺浓度下油球藻叶绿素a (a )和叶绿素b (b)含量变化

2.2 Y3+离子浓度对油球藻的生理影响

微藻在受到外界因素刺激时藻细胞会促进分泌胞外聚合物(EPS) , 主要包括可溶性多糖和蛋白质等物质,以应对不利影响如图3所示,在Y3+浓度较低时, 蛋白质含量变化明显,实验初期有所上升,但随后趋于稳定或略有下降。而15 mg/L时蛋白质的分泌明显受到抑制,且期间都保持在一个相对较低的水平。 与蛋白质类似,对照组的多糖含量也随时间推移而波动增长, γ3+在1 mg/L和5mg/L时,多糖的含量增加,培养结束时两组的多糖浓度分别为108.10 mg/L和105.14 mg/L , 10 mg/L时增长变化不大,维持在90mg/L左右,但Y3 +浓度增加到15 mg/L时,多糖开始呈现下降趋势,并且随着时间的推移下降越明显,培养结束时仅有41.16 mg/L ,远低于其他各组。这也说明Y3 +在较低浓度下会刺激微藻生长并做出应激反应。

图3 Y³⁺对油球藻EPS的影响

图4反映了油球藻在Y3+的胁迫下抗氧化系统的变化趋势,微藻在较低浓度Y3+环境下,总抗氧化能力( T-AOC )迅速上升,表明油球藻启动了抗氧化防御机制,这种响应涉及非酶抗氧化剂的积累, γ3+浓度增加后, T-AOC的增长趋势开始下降,抗氧化系统受严重破坏,无法继续有效应对高水平的Y3+胁迫。两二醛( MDA )含量有所不同,随Y+浓度的增加而上升,第5天15 mg/L的Y³⁺胁迫下藻细胞MDA含量达到最高0.077 nmol/104cell。MDA是脂质过氧化产物,在一定范围内,细胞氧化越严重,含量越高。随着γ3+浓度的增加,谷胱甘肽( GSH)水平先升后降。上升 是GSH的合成以应对氧化压力,随后下降则由于GSH被自由基大量消耗,且其合成速度无法跟上消耗速度。GSH是一种非酶抗氧化剂 ,保护细胞免受氧化损伤14]。类胡萝卜素具有抗氧化活性,保证光合体系的稳定性和膜的完整性。γ3+ 在10 mg/L时对类胡萝卜素的合成依然有促进作用,并且在5 mg/L时促进作用最为明显,其最终含量达到了1.79 mg/L.

图4 不同Y³⁺浓度下油球藻T-AOC(a)、MDA(b)、GSH(c)、类胡萝卜素(d)含量变化

2.3油球藻对Y³⁺的生物去除效果

图5反映了油球藻生物去除重金属的能力,各组去除率均随时间的增加而逐渐上升,说明油球藻在处理过程中持续发挥作用,有效降低了废水中的Y³⁺含量。Y³⁺的初始浓度较低时,去除率在短时间内就达到了较高的水平,培养第4天时1 mg/L的去除率达到75.79%并趋于稳定, 5 mg/L组的去除率最高为82.72%。随着Y^{3 +}初始浓度的增加,虽然去除率仍然上升,但达到稳定状态所需的时间也相应延长。无论初始浓度如何,经过油球藻处理后,废水中的Y3+浓度均有所下降，去除率随时间逐步增高。

图5 油球藻对Y³⁺的去除效果

2.4微藻对Y3+的吸附效果研究

图6表示240 min内藻液中剩余Y3+含量的变化趋势。Y³⁺ 浓度在短时间内下降较快, 24 mg/L时两种培养方式下的剩余浓度最终分别为4.36 mg/L和3.13 mg/L ,最终去除率分别为81.98%和86.94%。6 mg/L和12 mg/L下的吸附情况较好,吸附结束时的浓度均在0.5 mg/L左右。两组Y3+浓度变化趋势类似,但缺氮( N2 )组的最终稳定浓度略低于富氮(N1 )组,去除Y3+的效果更优,表明缺乏硝态氮的培养更有利于Y³⁺的去除。

图6: N1 (a )和N2( b )两种培养方式下Y^3＋的浓度

2.5吸附模型拟合与分析

不同培养方式下的油球藻对Y³⁺的动力学拟合结果见表1。在两种培养方式下,油球藻对Y3+的吸附量均较低,平衡时的吸附量均在20 mg/L左右,且N2组拟一-级和拟二级动力学的平衡吸附量为19.96 mg/g和20.41 mg/L ,均高于N1组的19.42 mg/g和20.27 mg/g ,缺乏硝态氮的培养条件对于油球藻吸附Y3+略有提高。对比相关系数可以发现,拟二级动力学的R2更接近1 ,且其吸附值更接近测量结果,两组结果分别为19.81 mg/g和20.81 mg/g ,说明油球藻在吸附Y3+时,更符合拟二级动力学模型。

等温线的拟合结果如表2所示,评估了Langmuir. Freundlich和Sips等温线模型 , 在两种培养方式下,油球藻都显示出对Y^3＋的有效吸附能力, Sips模型的R2更高-些,似乎更适合用来描述油球藻吸附Y3+。303 K下N1组的L angmui模型的最大吸附量qm略高于N2组,但N2组Sips模型的qm明显较高,达到了72.77 mg/g ,远高于N1组的49.76 mg/g ,且283K时N2组的qm均高于N1组,这表明缺氮培养具有明显优势。Langmuir模型的R2值最小,其拟合程度相对较差, Sips模型更适合描述Y3+的吸附过程。三种等温线拟合情况较好, Langmuir模型的参数具有明确的物理意义,因此一般优先考虑L angmuir模型。

表2 两种培养方式下油球藻吸附Y³⁺的等温吸附模型参数

Langmuir和Sips常用于确定热力学参数,而Freundlich因其物理意义存在一争议而并不适合计算热力学参数。热力学拟合结果见表3 , Langmuir模型的热力学行为相似且大小接近, Sips模型相差较大, N1组的结果显示油球藻吸附Y³⁺是吸热且无序的自发过程,细胞表面更易与Y3+结合。△G对两种生理状态都是负的,表明是自发吸附,其能量级随温度升高而降低,吸附在较低温度下更容易展开。OH表示在相同温度和压力下吸附过程涉及的总能量, Flores等17]考 虑了三个0H范围: 4~8 kJ/mol、8~40 kJ/mo和大于40 kJ/mol。分别对应含范德华力的物理吸附,氢键与化学吸附。根据这个标准, 这是以离子交换为主的化学吸附过程,其中包括了物理相互作用和氢键。OS有 正负,表明不同培养方式影响了细胞表面物质,△S为负值时, 细胞表面活性位点对吸附物的亲和力较低。Langmuir模 型的△S为低负值,是物理过程的非特异性,对Y3+的亲和力更高,而这种吸附可认为是弱键结合,易导致Y³⁺的解吸。

表3 两种培养方式下油球藻吸附Y3+的热力学参数

2.6 FTIR分析

微藻的细胞壁由多糖、蛋白质、脂质组成的,这些物质可以提供与金属离子结合的位点[191。图7为油球藻吸附Y3+的FTIR光谱图,吸附Y3+的主要官能团没有发生重大变化,仅有一些吸收峰发生偏移。 3200~3300 cm-1和1540~ 1550 cm 1处均发生偏移,说明N-H(蛋白质)和C-N (酰胺I )都参与了γ3+的吸附。N2组在C-H ( 2850 cm-1 )发生了偏移或拉伸, C=O ( 1700~1630 cm-1)出现了明显的移动,表明酰胺I在Y³⁺的吸附过程中有较大作用。-OH ( 1390~1330cm-1) , P=O ( 1260~1000 cm-1)和C- -0-C ( 1020~ 1000 cm-1 )存在不同程度的偏移或拉伸,这三个键中的共同元素是氧,而氧的电负性相对较大,因此部分带负电,易与带正电的Y3+结合。酯基和磷酸盐是常见的包含P=O和C- 0- C的官能团,在细胞壁中含量丰富。这些基团具有双齿复杂结构,特别适合与离子结合。

图7 N1（a）和N2（b）两种培养方式下油球藻吸附Y^3＋前后的FTIR光谱

如图8所示,酰胺I是最高峰可能是由于细胞壁中蛋白质含量增加或细胞壁厚度减少,蛋白质更多地暴露在细胞表面,加强了红外光谱吸收。缺氮培养下N- H和C一N的峰相对强度要低于 富氮培养,但是C- 0- C在1000 cm 1左右处的峰强度更高,说明更多的碳水化合物充当了细胞壁成分。在培养过程中硝态氮的缺乏会促使微藻中产生脂质和碳水化合物,多糖有助于C- H ( 2960~2850 cm~1 )增加相对强度。N2组在1700~1740 cm 1范围检测出羧基(一COOH ),表明在硝态氮限制 上细胞壁的组成存在相关差异,这可能与脂质和糖醛酸有关, Gerken等2通过酶消化确定了小球藻( C. vulgaris )细胞壁上存在糖醛酸。氮限制下微藻细胞壁可能会产生一COOH ,这可以增加一定的吸附能力,这类羧基可能来自果胶和糖醛酸,可以游离或与甲基发生酯化反应r22-241。C-0- C在1000~ 1040 cm-处峰度较大,这是醛糖中的醚键和环状结构中的酮糖的主要特征,且与氮限制下微藻细胞壁增厚有关, Yap等发现,氮限制下色球藻( Chlorococcussp. )的细胞壁厚增加了25%。这说明在培养到一定程度时,环境光照强度不能为微藻提供足够的光照,导致两种情况下均会因光照不足而增加蛋白质或适当削减细胞壁厚度,而N2组缺氮,因此细胞壁厚度会有部分增加。

图8 N1 (a )和N2 ( b )两种培养方式下油球藻的FTIR光谱

( 1 ) Y3+对油球藻有“低促高抑”的作用,在5 mg/L左右,微藻生物量,光色素, EPS和抗氧化体系均有所提高,大于10 mg/L时抑制作用明显。油球藻对Y³⁺具有一定的生物富集能力, 5 mg/L以下时去除率较高,达到82.72%。

( 2 )缺氮培养有利于微藻吸附Y3+,缺乏 硝态氮培养下油球藻对Y³⁺的去除率达到86.94% ,高于富氮培养下的81.98% ,吸附过程可用拟二级动力学拟合,以化学吸附为主,缺氮培养组吸附自发性和平衡性在较高温度下降低,并且该过程明显放热,需要更多的能量。

( 3 )吸附过程有细胞表面大量能团参与,缺氮条件细胞壁碳水化合物含量增多,出现羧基,细胞壁厚有所削减,这导致了缺氮培养吸附效果更优。