褐藻胶是由β_D-甘露糖醛酸( β-D-mannuronate , M )和a-L-古罗糖醛酸( ax-L-guluronate , G )通过1 , 4-糖苷键聚合形成的线性多糖,要存在于海带、骣藻等褐藻细胞壁中。根据单体组成差异,褐藻胶可分为3类:聚甘露糖醛酸( poly M)、聚甘露糖醛酸( poly G )以及两种单体组成的杂多糖( poly MG )。褐藻胶具有高粘度、胶凝性、保水性等性质,在食品行业中被广泛用作增稠剂。此外,褐藻胶及褐藻胶复合材料还在伤口敷料、药物递送与组织I程等生物医学领域中具有重要应用价值。然而,褐藻胶的聚合度高、溶解性差、生物利用度低,严重限制了它的生物活性和应用领域拓展。

褐藻寡糖( alginate oligosaccharides , AOS )是褐藻胶的降解产物,具有多种生物活性,比如抗菌、抗氧化、免疫调节、益生元活性及促进植物生长等,在农业、生物医学及食品工业中具有巨大的应用潜力。研究表明,褐藻寡糖的独特功能与特定的结构密切相关，包括分子量、聚合度( degrees of polymerization, DP )、甘露糖醛酸/古罗糖醛酸( M/G )比、单体序列和末端饱和度等。 目前, AOS的相关研究和应用大多基于AOS的混合物,很少有古罗糖醛酸寡糖制备的报道,导致其结构与功能的关系未能明确。

因此,定向制备具有特定结构的古罗糖醛酸寡糖对其后续生物活性的研究和新型功能活性物质的发掘具有重要的意义。褐藻胶裂解酶通过β消除机制催化褐藻胶降解为褐藻寡糖。根据氨基酸序列的相似性,褐藻胶裂解酶可分为15个多糖裂解酶家族,分别为PL5、6、7、8、14、15. 17、18、31、32、 34、36、39、41和44 (。根据底物特异性不同，褐藻胶裂解酶可分为特异性降解聚甘露糖醛酸的裂解酶( EC 4.2.2.3)、特异性降解聚古罗糖醛酸的裂解酶( EC 4.2.2.11 )和两种均能降解的双功能酶( EC 4.2.2.- ) 3类。PL7家族褐藻胶裂解酶的保守序列Q(I/N)H 与底物特异性相关, QIH的存在通常意味着该酶对poly G或poly MG具有偏好性。根据催化方式,大部分已报道的褐藻胶裂解酶属于内切酶,多为PL5和PL7家族,外切酶主要集中于PL15和PL17家族7。目前已从不同生物体中分离出褐藻胶裂解酶,但野生型菌株产酶量较低,无法满足工业生产的需要。异源表达,如来源Rubrivirga marina的褐藻胶裂解酶AlyRm1已在大肠杆菌中成功表达。来源于Alteromonas portusHB1617181的具有适冷特性的褐藻胶裂解酶Alg2951在大肠杆菌中成功表达,胞外酶活力为63.6 U/mL。毕赤酵母表达系统在生产许多重组蛋白方面具有显著优势,如蛋白分泌能力高、产物分离简单、无内毒素等,但目前仅有少部分的褐藻胶裂解酶基因在毕赤酵母中成功表达。

本研究从溶藻弧菌( Vibrio alginolyticus )中发掘了-种新型褐藻胶裂解酶基因VaAly7 ,将其导入毕赤酵母中,利用高密度发酵实现高效表达。研究了重组酶( VaAly7 )的酶学性质和水解特性,进一步将该酶用于聚古罗糖醛酸的降解,为罗糖醛酸寡糖的制备提供一定的依据。

褐藻胶裂解酶VaAly7在毕赤酵母中的表达

从NCBI数据库中发掘到褐藻胶裂解酶基因序列( VaAly7 ),因合成后 设计引物进行PCR扩增,将PCR产物和pPIC9K载体连接成重组质粒pPIC9K-VaAly7,重组质粒经限制性内切酶SalI线性化 ,电转化至毕赤酵母GS115中并涂在MD平板上。

用30% ( w/v)甘油重悬MD平板上生长的重组酵母,将其涂布在不同浓度( 1、2、3和4 mg/mL )的G418平板上,进行高拷贝筛选。挑取G418平板上的单菌落于BMGY培养基, 30℃，200 r/min培养24 h ,以10%接种量加入BMMY培养基中,于相同培养条件下诱导目的蛋白表达,每24 h补加无水甲醇, 3 d后测定发酵上清液中褐藻胶裂解酶酶活力。

褐藻胶裂解酶VaAly7的高密度发酵

将酶活力最高的菌株在5 L发酵罐中进行高密度发酵。参照李延啸等I1 1]的方法,将种子液接种于5L发酵罐,发酵条件为30℃、pH 4.0和600 r/min ;溶氧上升后开始流加50% ( w/v)甘油,调节pH为5.0 ,待菌体湿重达到180-220 g/L时停止流加并饥饿0.5 h ;最后流加甲醇诱导,发酵条件为30℃、pH 6.0和800 r/min。发酵过程中每12 h取样测定菌体生长及蛋白表达情况。

褐藻胶裂解酶VaAly7的酶活力及蛋白含量测定

褐藻胶裂解酶酶活力采用DNS法[12]进行测定。将100 μL的酶液与900 μL的褐藻胶溶液( 0.3% (w/v) , 50 mmol/L pH 7.0 Tris-HCI)混合, 30。C反应10 min ,加入750 μL DNS ,煮沸10 min显色,立即冷却后测定反应体系在540 nmi下的吸光值。将褐藻胶裂解酶酶活力单位( U )定义为每分钟产生1 umol还原糖所需要的酶量。蛋白含量参考Lowry的方法测定。

褐藻胶裂解酶VaAly7的纯化

取发酵液10000r/min离心5 min ,收集上清液即为粗酶液。将粗酶液在50 mmol/L pH 8.0 PB缓冲液中透析过夜,以0.5 mL/min的流速.上样于PB缓冲液预平衡的QSFF强阴离子交换层析柱,用PB缓冲液洗脱5个柱体积,之后用含0-500 mmol/L NaCI的PB缓冲液线性洗脱,收集具有褐藻胶裂解酶酶活力的组分, SDS-PAGE分析蛋白纯度。

褐藻胶裂解酶VaAly7的酶学性质测定

最适pH :测定褐藻胶裂解酶在30℃、50 mmol/L的不同pH缓冲液条件下酶活力,以最大值为100% ,计算各pH下的相对酶活力。pH稳定性:将酶液用50 mmol/L的不同pH缓冲液适当稀释, 25℃保温30 min后冰水浴30 min ,在最适条件下测定残余酶活力,以未经处理酶液的酶活力为100% ,计算残余酶活力所占的百分比。上述所用缓 冲体系及pH范围分别为柠檬酸盐缓冲液( pH 3.0-6.0)、PB缓冲液( pH 6.0-8.0)、Tris-HCl缓冲液( pH 6.0-9.0 )、CHES缓冲液( pH 8.0-10.0 )和CAPS缓冲液( pH 10.0-11.0)。

最适温度:测定褐藻胶裂解酶在不同温度( 15-40℃)、50 mmol/L pH 7.0 Tris-HCl缓冲液条件下酶活力,以最大值为100%计算各温度下的相对酶活力。温度稳定性:将酶液用50 mmol/L pH 7.0 Tris-HCl缓冲液适当稀释,同温度( 15-40 ℃ )保温30 min后冰水浴30 min ,在最适条件下测定残余酶活力,以未经处理酶液的酶活力为100% ,计算残余酶活力所占的百分比。

半衰期:将酶液用50 mmol/L pH 7.0 Tris-HCl缓冲液适当稀释,分别在25、30、35 ℃下保温4 h ,不同时间点取样并冰水浴30min ,在最适条件下测定残余酶活力,以未经处理酶液的酶活力为100% ,计算残余酶活力所占的百分比,酶活降低至50%所用时间为相应温度下的半衰期。

NaCI对褐藻胶裂解酶VaAly7酶活泐的影响

配制0.3% ( w/v )的褐藻胶溶液( 50 mmol/L pH 7.0 Tris-HCI) , 加入NaCI使反应体系中NaCl浓度为0-1 mol/L ,测定不同NaCl浓度下的褐藻胶裂解酶酶活力,以未加NaCI时的酶活力为100% ,计算不同NaCI浓度下相对酶活力。

褐藻胶裂解酶VaAly7的底物特异性及水解特性

分别配制0.3% ( w/v )的poly M、poly G和褐藻胶溶液,测定褐藻胶裂解酶对各底物的酶活力,以褐藻胶为底物时的酶活力为100%,计算各底物下的相对酶活力。分别配制1% ( w/v )的褐藻胶、poly M、poly G和古罗糖醛酸寡糖( G2-G5) , 加酶量1 U/mL, 30℃水解12 h ,分别在不同时间点取样,样品煮沸5 min灭活,于10000 r/min离心5 min ,薄层层析法分析上清液中产物组成,展层剂为正丁醇:甲酸:水( 2: 1: 1, VN/V)。

聚古罗糖醛酸的分离制备

制备聚古罗糖醛酸参考Hau的方法并略作修改。配制2% ( w/v )的褐藻胶溶液,电动搅拌机搅拌使其溶胀,加入浓盐酸使体系HCl浓度为0.5 mol/L , 100 ℃酸解10 h , 4000 r/min离心10 min弃上清。用8% ( w/v )的NaHCO3溶解沉淀,用0.3 mol/L的稀盐酸调pH至2.85产生大白色絮状沉淀, 4000 r/min离心10 min ,得沉淀。

将沉淀加水稀释至6% ,用10% ( w/v )的NaOH溶液调pH至中性,使沉淀溶解,过滤除杂,用0.3 mol/L的稀盐酸调pH至2.85 ,得沉淀,将上述操作重复2-3次,即得较高纯度的聚古罗糖醛酸粗品。利用-815圆二2色谱仪测定圆二色光谱并分析poly G的M/G比。配制0.1% ( w/v )的溶液,使用光程长度为1 mm的石英池在波长190 nm-250 nm范围内进行扫描,以水为基准物,扫描温度为25℃。

椤糖醛酸寡糖的制备

配制10% ( w/v )的polyG ,加酶量100 U/g , 30℃酶解6 h , 100℃煮沸5 min灭酶, 4000 r/min离心10 min,取上清,得古罗糖醛酸寡糖。

将样品过0.22 μm滤膜,利用ESI-MS测定古罗糖醛酸寡糖的组成。采用高效凝胶渗透色谱法( HPGPC )分析褐藻胶、poly G酶解前后分子量,测定条件为: TSK-gelG3000PWXL 色谱柱,流动相0.1 mol/L NaNO3 ,柱温30℃，检测器温度30℃,流速1 mL/min。

数据分析

采用Origin 2022对数据统计分析及绘图。

褐藻胶裂解酶VaAly7的序列分析

褐藻胶裂解酶VaAly7基因全长为1299 bp ,编码432个氨基酸。通过ExPASy ProtParam预测VaAly7的分子量和等电点分别为47.3 kDa和4.32。NCBI BLAST序列此对结果显示, VaAly7与来源Vibriosp. SY01的PL 7家族的褐藻胶裂解酶Aly08 ( 84.89% , QCX08462.1 )同源性最高,其次为Agarivoranssp. L11来源的褐藻胶裂解酶AlyL2 ( 83.10% , AJ061885.1 ) 和AlyL11 ( 83.10% ,AIY68685.1 )及Vibriosp. QY104来源的褐藻胶裂解酶AlyV4 ( 74.94% , AGL78596.1) 。因此, VaAly7属于PL7家族的一种新型褐藻胶裂解酶。

多重序列此对结果显示,褐藻胶裂解酶VaAly7包含PL7家族褐藻胶裂解酶的三个典型保守序列: RTEL、QIH和YFKAGIYLQ ,其中由QIH可推测VaAly7对poly G具有偏好性，与来源于Flammeovirgasp.20的褐藻胶裂解酶FsAly7和来源于Formosaagariphila KMM3901的褐藻胶裂解酶OUC-FaAly7类似。

图1 VaAly7与駝PL 7家族褐藻胶裂解酶多重列比对

褐藻胶裂解酶VaAly7的高密度发酵

褐藻胶裂解酶VaAly7在毕赤酵母GS115中成功表达,取酶活力最高的菌株进行高密度发酵,发酵历程如图2A所示,经甲醇诱导168 h后,菌体湿重为307.1 g/L , 发酵上清液褐藻胶裂解酶酶活力为413 U/mL ,蛋白浓度为7.1 mg/mL。SDS PAGE分析结果显示,目的条带随发酵时间的延长逐渐加深,褐藻胶裂解酶含量逐渐增多(图2B )。

目前已有几种褐藻胶裂解酶在毕赤酵母中表达的报道。来源Flammeovirgasp.!221的褐 藻胶裂解酶mFsAly7表达在毕赤酵母中,经高密度发酵144 h后,酶活力为3125.5 U/mL ,是目前已报道褐藻胶裂解酶的最高表达水平。Vibrio fortis来源褐藻胶裂解酶VfAly7在毕赤酵母中高效表达,酶活力最高为560 U/mL。此外,来源于Microbulbifersp. Q7和Vibriosp.的褐藻胶裂解酶表达在毕赤酵母中,酶活力分别为33.82 U/mL和45.4 U/mL ,低于本研究水平。本研究中的褐藻胶裂解酶VaAly7在毕赤酵母中高效表达,酶活泐最高为413 U/mL,在工业生产方面具有一定优势。

图2 褐藻胶裂解酶VaAly7高度发酵历程( A)及SDS-PAGE分析(B )

褐藻胶裂解酶VaAly7的纯化

褐藻胶裂解酶VaAly7用QSFF柱纯化, VaAly7纯酶的比酶活力为86.1 U/mL ,纯化倍数为1.5 ,回收率为76% (表1)。SDS-PAGE分析结果显示VaAly7分子质量约为44 kDa ,经Endo H去糖基化酶处理后在电泳图上呈现单一条带(图3 )。

褐藻胶裂解酶的分子质量通常在24- 110 kDa。VaAly7的分子质量约为44 kDa ,与来源Tamlanasp. s12的褐藻胶裂解酶( 44.6 kDa)相似,同属于中等分子质量的褐藻胶裂解酶。

 表1 褐藻胶裂解酶VaAly7的纯化表

图3 褐藻胶裂解酶VaAly7的纯化图

褐藻胶裂解酶VaAly7的酶学性质

褐藻胶裂解酶VaAly7的最适pH为7.0 (图4A) , 在pH 4.0-9.5下孵育30 min后仍能保持80%以上的酶活力(图4B )。该酶的最适温度为30℃ (图4C) ,在30℃及以下孵育30 min能保持80%以上的酶活力(图4D) , 该酶在25℃、30℃、35℃下的半衰期分别是878 min、207 min和15 min (图4E )。

大部分褐藻胶裂解酶的最适pH接近于中性( pH 7.0-8.5 ),且在较窄的pH范围内保持稳定[25] ,如来源M. thermotolerans DSM 19189的褐藻胶裂解酶最适pH为7.0 ,在pH 6.0-8.0范围内保持稳定。VaAly7的最适pH为7.0 ,在pH 4.0-9.5范围内可保持80%以上的酶活力,具有较好的pH稳定性。适冷褐藻胶裂解酶的最适温度通常低于35℃ ,且在30℃以下具有较高的相对酶活力。如来源Tamlanasp. s12[26]和Thalassomonassp. LD5[29的褐藻胶裂解酶最适温度分别为35℃和30℃。VaAly7的最适温度为30℃ ,且在20℃、25℃下的酶活力可达到82%和96% ,属于适冷型褐藻胶裂解酶。VaAly7在30℃及以下保持稳定,表明褐藻胶裂解酶VaAly7可在常温下进行酶促反应。该酶的这一特性,可以在实际应用中一定程度上减少酶水解反应过程中的能源消耗。

图4 褐藻胶裂解酶VaAly7的最适pH (A)、pH稳定性(B)、最适温度(C).温度稳定性(D)伴衰期(E)

NaCI对褐藻胶裂解酶VaAly7酶活力的影响

NaCI浓度较低时,对褐藻胶裂解酶酶活力具有明显的促进作用，NaC|浓度为400 mM时酶活力最高,可达到对照组的8倍左右。同时VaAly7可耐受较高的NaCI浓度, NaCI浓度为1 M时VaAly7仍保持较高酶活力(图5 )。为了适应海洋的高盐环境,大部分褐藻胶裂解酶对NaC表现出依赖性或盐激活性131。如来源Agarivoranssp. L1的褐藻胶裂解酶AlyL2在没有NaCI时几乎检测不到酶活力。来源Vibrio weizhoudaoensisM0101和Flammeovirgasp的褐藻胶裂解酶AlgM4和FsAly7经1 mol/L和0. 5mol/L的NaCI处理后酶活力最高可增加至7倍和1.5倍。VaAly7的酶活力在NaCl浓度为400 mmol/L时可增加至8倍,达到3634 U/mL ,是目前已报道的褐藻胶裂解酶酶活力的最高水平。VaAly7是 盐激活性褐藻胶裂解酶,其盐激活特性可能与NaCl改变酶分子的二级结构、增加酶与底物的亲和力有关。本研究中VaAly7对NaCl没有依赖性且具有盐激活特性,因此其可以在多种加工过程中降解褐藻胶,如褐藻肥或褐藻寡糖的生产。

图5 NaCI对褐藻胶裂解酶VaAly7的影响

褐藻胶裂解酶VaAly7的底物特异性及水解特性

褐藻胶裂解酶VaAly7对褐藻胶、poly M、poly G的相对酶活力分别为100%、98%、189% (表2 )。VaAly7降解褐藻胶的历程如图6A所示,反应初始阶段即产生单糖、DP2-4的褐藻 寡糖及一系列较高聚合度的寡糖 ,随着反应时间的延长,聚合度的寡糖逐渐降解,低聚合度的褐藻寡糖增多。褐藻胶裂解酶VaAly7降解poly G可生成DP2-4的古罗糖醛酸寡糖,降解poly M主要生成一系列较高聚合度寡糖(图6B )。VaAly7不能水解G2、G3、 G4 ,但能够降解G5生成古罗糖醛酸二糖(图6C)。

VaAly7对poly M和poly G均有降解活性,对poly G的酶活力最高,该酶属于双功能褐藻胶裂解酶,且对poly G具有偏好性,与2.1中关于VaAly7底物特异性的推测结果一致。大多数褐藻胶裂解酶的降解产物主要是二糖至六糖 ,如来源Microbulbifer sp. Q7的褐藻胶裂解酶cAlyM主要产物为DP2-4的褐藻寡糖[24]。而VaAly7产物包括单糖、DP2-4的褐藻寡糖及-系列较高聚合度的寡糖。大多数褐藻胶裂解酶降解poly G、poly M和褐藻胶的产物组成相似,比如褐藻胶裂解酶Aly448降解三种底物的产物为单糖、二糖和四糖。

而VaAly7降解poly G和poly M的产物具有明显差距,这与其严格的底物特异性有关。VaAly7对poly G降解更为彻底,可降解的最短链底物为古罗糖醛酸五糖,可用于降解poly G制备古罗糖醛酸寡糖。

表2 褐藻胶裂解酶VaAly7的底物特异性

图6 褐藻胶裂解酶VaAly7降解褐藻胶( A). poly G和poly M(B )及古罗糖醛酸寡糖G2-G5 (C )的TLC分析图

聚古罗糖醛酸的圆二色谱分析

聚古罗糖醛酸的圆二色谱如图7所示。甘露糖醛酸在200 nm附近有一一个波峰,古罗糖醛酸在215 nm附近有一个波谷,根据峰高和波深的比值可确定甘露糖醛酸和古罗糖醛酸的相对量1 51。制备的聚古罗糖醛酸的M/G比值为0.21 ,纯度为82%。

图7 聚古罗糖醛酸的圆二色谱图

古罗糖醛酸寡糖的制备

利用褐藻胶裂解酶VaAly7水解10% ( w/v )的聚古罗糖醛酸6 h，古罗糖醛酸寡糖的得率为86%。利用ESI-MS分析水解产物的组成，要包括单糖、二糖、三糖、四糖和五糖(图8A)。GPC分析结果显示,褐藻胶的分子为2327 kDa ,制备的聚古罗糖醛酸分子为11.5 kDa ,古罗糖醛酸寡糖的分子为2.1 kDa (图8B)。

Hu等人通过微波降解法制备DP1-10的GAOS ,产物得率为71% ,分子为3.2 kDa[34]。褐藻胶裂解酶Algt1降解20% ( w/v )的polyG,得率为79.6% ,产物主要包括单糖、二糖、三糖、四糖。Boucelkha等利用褐藻胶裂解酶降解polyG , 30℃反应6h,生成的GAOS分子量为3.742 kDa。与之前降解poly G的报道相比较, VaAly7降解poly G的效率更高,产物聚合度和分子更低。研究表明,与甘露糖醛酸寡糖相比,高古罗糖醛酸含量的褐藻寡糖主要作用为抗病原体和免疫调节。低分子量的AOS表现出良好的抗凝活性,可以抑制血栓形成。因此, VaAly7在生产高附加值古罗糖醛酸寡糖方面具有潜在价值。

图8 聚古罗糖醛酸降解产物的组成(A)及分子量(B )分析

溶藻弧菌来源的褐藻胶裂解酶VaAly7成功在毕赤酵母中实现异源表达,通过高密度发酵技术酶活力最高达到413 U/mL。褐藻胶裂解酶VaAly7的最适温度和最适pH分别是30℃和7.0 ,是一种适冷性褐藻胶裂解酶。同时,该酶具有盐激活性, 400 mmol/L NaCI下酶活力可提高8倍。该酶能够特异性降解聚古罗糖醛酸生成低分子量古罗糖醛酸寡糖,得率为86% ,在古罗糖醛酸寡糖的生产中具有应用潜力。本研究为褐藻胶裂解酶在毕赤酵母中的高效生产及古罗糖醛酸寡糖的制备提供了依据。